Генная инженерия. Методы и основные ферменты

1.

Авторы статьи: к.б.н. Крылова Е.В.
Селивёрстова А.А.
Генная инженерия. Методы и основные ферменты.
Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

2.

Метод специфического расщепления ДНК рестрицирующими
нуклеазами, ускоряющий выделение и манипуляции с отдельными
генами
Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

3.

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте
ДНК
Позволяет
определить
границы
гена
и
аминокислотную
последовательность,
кодируемую им
Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

4.

Конструирование рекомбинантной ДНК
Если необходимо сшить фрагменты,
образованные
разными
эндонуклеазами
рестрикции,
и
имеющие
разные,
то
есть
некомплементарные
друг
другу
липкие концы, применяют так
называемые
линкеры
(или
"переходники"). Линкеры — это
химически
синтезированные
олигонуклеотиды, представляющие
собой сайты рестрикции или их
комбинацию.
Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

5.

Гибридизация нуклеиновых кислот
Гибридизация ДНК основана на образовании водородных
связей
между
комплементарными
основаниями
одноцепочечных молекул. Для этих целей синтезируют ДНКзонд, который будет комплементарен искомой нуклеотидной
последовательности.
Эдвин Саузерн
Позволяет выявлять специфические последовательности РНК
или ДНК с большей точностью и чувствительностью,
основанную на их способности связывать комплементарные
последовательности нуклеиновых кислот. Метод основан на
возможности образования двуцепочечных гибридов между
искусственно создаваемых на основе одноцепочечных
последовательностей (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или
полинуклеотидных) мечеными зондами и комплементарными
им последовательностям в мишенях - анализируемых
молекулах ДНК или РНК.
Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

6.

Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

7.

Клонирование ДНК
Клонирование ДНК: амплификация
in vitro с помощью цепной
полимеразной
реакции
или
введение
фрагмента
ДНК
в
бактериальную клетку, которая после
такой трансформации воспроизводит
этот фрагмент в миллионах копий
Полное или частичное копирование, распространение или цитирование без разрешения автора не допускается!

8.

Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы

9.

История развития генетической инженерии.
Датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С.
Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса
SV40, бактериофага и E. coli.

10.

Важнейшим достижением генетической инженерии является создание генноинженерного инсулина, идентичного человеческому инсулину, производство
эритропоэтина в культуре клеток животных, создание трансгенных животных для
проведения лабораторных и клинических исследований.
Во второй половине двадцатого века Фредериком Сенгером и Уолтером Гилбертом
предложены методы, позволяющие изучать первичную структуры молекул ДНК.

11.

Историю развития можно
условно разделить на три этапа.
Первый этап - доказательство принципиальной
рекомбинантных молекул ДНК in vitro.
возможности
получения
Второй этап - работы по получению рекомбинантных молекул ДНК между
хромосомными генами прокариот и различными плазмидами
Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК,
используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат
клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.

12.

13.

Ферменты генетической инженерии
1.Рестриктазы
2.Полимеразы
3.РНК (обратные транскриптазы)
4.Лигазы
5. Терминальные трансферазы
6.Нуклеазы

14.

1.Рестриктазы
В 1968 г. Мезельсон и Юань
выделили
рестриктазу,
которая
расщепляет не метилированную
ДНК. Данный фермент оказался
высокоспецифичным по отношению
к определенной последовательности
ДНК, но в тоже время был способен
расщеплять
молекулы
неспецифичные для него, которые
находились вне участка узнавания.

15.

1.Рестриктазы
В 1970 г. Смит и Вилькокс
выделили из Haemophilus
influenzae первую рестриктазу,
которая расщепляла строго
определенную
последовательность
ДНК
(Hind III).

16.

1.Рестриктазы
В 1978 году Вернеру Арберу, Дэну Натансу и Гамильтону Смиту была
присуждена Нобелевская премия за получение первых рестриктаз, изучения их
свойств и практического применения для картирования хромосом.

17.

1.Рестриктазы
В зависимости от специфики сайтов узнавания рестриктазы разделены на три класса:
1. Первый класс – рестриктазы, которые способны узнавать определенную
последовательность нуклеотидов и разрезать молекулу ДНК в произвольном месте,
недалеко от сайта рестрикции.
2. Второй класс – рестриктазы, которые способны узнавать определенную
последовательность нуклеотидов и разрезать молекулу ДНК в определенном месте,
внутри сайта рестрикции. Рестриктазы данного класса узнают палиндромные
последовательности нуклеотидов, которые одинаково считываются в обоих
направлениях.
3. Рестриктазы третьего класса способны узнавать определенную последовательность
нуклеотидов и разрезать молекулу ДНК, отступив несколько нуклеотидов от сайта
узнавания. При этом могут образовываться фрагменты ДНК с «тупыми» (ровными) или
«липкими» (выступающими концами. Ферменты этого класса могут узнавать
несимметричные сайты.

18.

1.Рестриктазы

19.

1.Полимеразы
Способствуют синтезу ДНК на
матрице ДНК
Впервые ДНК-полимераза была
выделена Корнбергом в 1958 году из
E. coli.

20.

Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи и имеет 3-х
доменную структуру. Интересно, что каждый домен обладает своей
ферментативной активностью (5’ – 3’ полимеразной, 3’- 5’ экзонуклезной,
5’ – 3’ экзонуклеазной).
1. 5’ – 3’ полимеразная активность.
2. 3’- 5’ экзонуклеазная активность.
3. 5’- 3’ экзонуклеазная активность.

21.

22.

3. РНК (обратные транскриптазы)
Обратная транскриптаза используется для транскрипции мРНК в комплементарную
цепь ДНК.
В 1964 г. Говард Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного
фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК.

23.

3. РНК (обратные транскриптазы)
В 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый
фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса.
Дэвид Балтимор
РНК-зависимая
ДНКполимераза
получила
название
обратная
транскриптаза, или ревертаза. обладает,
по крайней мере, тремя ферментативными
активностями:
1) ДНК-полимеразной, использующей в
качестве матрицы как РНК, так и ДНК;
2) активностью РНКазы Н, гидролизующей
РНК в составе гибрида РНК—ДНК, но не
одно- или двухцепочечную РНК;
3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

24.

25.

4. Лигазы

26.

5. Терминальные трансферазы
Позволяют осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.
Используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в
3 -концы ДНК, а также присоединения к 3 -концам фрагментов ДНК (особенно
кДНК)
протяжённых
гомополимерных
последовательностей
нуклеотидов
(коннекторов) для последующего их клонирования.

27.

6. Нуклеазы

28.

Спасибо за внимание!