Мониторинг слизней рода Arion на носительство бактерий Listeria monocytogenes

1.

Мониторинг слизней рода Arion на носительство
бактерий Listeria monocytogenes
Выполнила:
ученица 10 класса
МБОУ «Гимназия №4»
Холоднова Мария Константиновна
Руководитель:
Васильцова Оксана Николаевна
Научный консультант:
Эйдельштейн Инна Александровна,
к.б.н., НИИ антимикробной
химиотерапии

2.

Актуальность работы
Рачевский овраг, Чёртов мост (вид сверху)

3.

Актуальность работы
Зона отдыха внутри оврага
Испанский слизень в ручье
Рачевского оврага

4.

Цель: мониторинг на носительство слизнями рода Arion
бактерии Listeria monocytogenes.
Задачи:
• Изучить биологические и экологические особенности испанского
слизня — Arion vulgaris.
• Определить места обитания слизня на территории города Смоленск.
• Взять пробы слизи и экскрементов слизней Arion vulgaris, обитающих в
Рачевском овраге.
• Исследовать биологические образцы на наличие бактерии Listeria
monocytogenes методом ПЦР.
Гипотеза: в биологических выделениях слизня Arion vulgaris
могут содержаться бактерии Listeria monocytogenes.

5.

Испанский слизень, Arion vulgaris
• Слизень испанский (Arion vulgaris), или слизень дорожный
испанский, или моложень испанский — вид наземных
стебельчатоглазых брюхоногих моллюсков рода арионы
(Arion) семейства арионид (Arionidae)
• Это крупные слизни оранжевого или коричневатого цвета,
реже тёмно-серого или почти чёрного. Их длина может
Испанскийслизень
слизеньвввручье
ручье достигать 120 мм (в отдельных случаях — около 150 мм).
Испанский
Испанский
слизень
ручье
Рачевскогооврага
оврага
Рачевского
Рачевского
• A. vulgaris долгое время ошибочно принимали за Arion
lusitanicus, описанного из Португалии Жюль Полем
.
Мабилем
в 1868 году.
Испанский слизень в траве

6.

Характеристика бактерии рода Listeria и
листериоза
Листерии — род грамположительных палочковидных бактерий. Некоторые виды
являются возбудителями заболеваний животных и человека. Листерии широко
распространены во внешней среде.
Листерия
(https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1007747)
Наиболее часто причастными к листериозу оказываются следующие пищевые продукты:
• продукты с длительным сроком хранения в холодильнике (при достаточно длительном
хранении при температурах, поддерживаемых в холодильнике, количество
(L. monocytogenes ) в продуктах может значительно увеличиться);
• продукты, потребляемые без последующей обработки, например без тепловой
обработки, которая позволила бы убить L. monocytogenes.

7.

Симптомы листериоза
неинвазивный
инвазивный
• более легкая форма болезни
• более тяжелая форма болезни
инкубационный период —
несколько дней
инкубационный период — от
нескольких дней вплоть до
90 дней
o диарея
o повышенная температура
o головная боль
o миалгия (мышечные боли)
o повышенная температуру
o миалгия (мышечные боли)
o септицемия (заражение крови)
o менингит

8.

Сбор биологического материала
Биологический материал был собран в Рачевском овраге, г. Смоленска.
Внутри оврага
Район сбора особей слизней.
Красным отмечен маршрут
(https://yandex.ru/maps/-/CCUBA4UY9D

9.

Методика сбора образцов биологического материала
Отловили 5 слизней возле
жилых домов,
расположенных в верхней
части оврага
Стерильным ватным
тампоном собрали слизь с
поверхности слизня, а
самого слизня положили в
банку и плотно закрыли,
оставляя отверстия для
дыхания
Отловили еще 5 слизней в
нижней части оврага вдоль
реки Рачевки через
определенное расстояние
и собрали образцы их
слизи

10.

Оставили собранных
слизней на сутки в банках
для получения
экскрементов
Стерильным ватным
тампоном собрали
экскременты слизней и
поместили в стерильные
пробирки

11.

Опыт по выделения ПЦР для определения
листерии.
Метод ПЦР
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод
молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых
концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в
биологическом материале (пробе).
• В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого
участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro).
В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для
визуальной детекции. При этом происходит копирование только того
участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том
случае, если он присутствует в исследуемом образце.
• Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже
если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

12.

Методика выделения ПЦР для определения
листерии Listeria monocytogenes
1. Выделение ДНК с помощью ДНК – СОРБ- АМ системой.
Набор реактивов
(https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/
vydelenie-i-ochistka-nukleinovykh-kislot-i-belkov/dnk-sorb-am-komplektreagentov-dlya-vydeleniya-dnk-iz-klinicheskogo-materiala.html)
2. Транспортная среда с муколитиком для растворения слизи
– объем 300 мл
Набор для приготовления транспортной среды
( https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/neyroinfektsii/
amplisens-listeria-monocytogenes-skrin-monitor-fl-vyyavlenie-listeria-monocytogenes.html
)
3. Взбалтывание пробы, отбор 100 мл раствора
4. Обработка исследуемого раствора с использованием набора для выделения ДНК,
с добавлением лизирующего буферного раствора, который растворяет оболочки клеток.

13.

5. Очищение выделенной ДНК (с использованием реагентов, которые входят набор
тест системы)
Набор реагентов для очищения ДНК
(https://nextbio.ru/catalog/transportnye-sredy/amplipraym-tsm/)
6. 10 мл раствора в микропробирке помещаем в прибор амплификатор
Амплификатор детектирующий ДТпрайм
(https://dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/rtamplificators/dt_prime)
7. В прибор устанавливаются 20 микропробирок с подготовленными пробами
8. В приборе пробы находятся 1 ч 45 мин
9. Обработка результатов.

14.

Результат ПЦР по обнаружении Listeria
monocytogenes
Было обработано 10 пробирок с пробами слизи слизня, вторые 10
пробирок — с экскрементами слизня (Приложение).
Вывод: тест-система ДНК рабочая, но канал HEX в таблице не отражает результатов,
значит, в исследуемых пробах слизи и экскрементов в ДНК Listeria monocytogenes
не обнаружено.

15.

Графики проведения ПЦР ДНК – СОРБ- АМ
системой на ДНК Listeria monocytogenes
Канал ROX показал
совпадения ДНК с ДНК
Listeria monocytogenes.
Канал FAM показал
совпадения ДНК с ДНК
Listeria monocytogenes.
Канал HEX не показал
совпадений ДНК с ДНК
Listeria monocytogenes.

16.

Общие выводы
1.
Местные жители, к сожалению, вынуждены терпеть дискомфорт,
проживая на одной территории со слизнями, которые кроме угрозы
заражения опасной инфекцией пугают жителей своим видом и яркой
окраской.
2.
Исходя из этого, проведено исследование на наличие бактерий Listeria
monocytogenes у 10 особей слизней, собранных в районе Рачевского
оврага г.Смоленска возле многоэтажных жилых домов и частных
домовых хозяйств.
3.
Тест-система ДНК рабочая, но канал HEX в таблице не отражает
результатов, значит, в исследуемых пробах слизи и экскрементов в ДНК
Listeria monocytogenes не обнаружено.
4.
Канал HEX не показал совпадений ДНК с ДНК Listeria monocytogenes
Канал FAM показал совпадения с тест-системой ДНК
Канал
ROX показал совпадения с тест-системой ДНК.
5.
В перспективе мы собираемся отслеживать распространение слизи на
территории города Смоленска и Смоленского района, в частности, обследовать
Чуриловский овраг города Смоленска.