Бактериологический метод исследования. Выделение чистых культур анаэробов

1.

Кафедра микробиологии
Заведующий кафедрой: Базиков Игорь Александрович
Титульный слайд
Подзаголовок

2.

Занятие №7.
Тема: бактериологический метод
исследования. Выделение чистых
культур анаэробов.

План занятия:
Общая цель занятия: научиться выделять чистую культуру анаэробов из исследуемого
материала, отработать навыки приготовления мазков из исследуемого материала и чистой
культуры, посевов и пересевов на плотных и жидких питательных средах, обучиться способам
создания анаэробных условий в лаборатории, ознакомиться с классическим методом лабораторной
диагностики анаэробных инфекций, идентификации и дифференцировки бактерий, применение
которого необходимо будущим специалистам в рамках обязанности врача.
• А. Обсуждаемые вопросы:
• Методы создания анаэробных
условий культивирования
микроорганизмов: физический,
химический, биологический.
• Этапы выделения чистой культуры
анаэробов.
• Питательные среды, используемые
при культивировании анаэробов.
•Б. Практическая работа:
•1.Этапы выделения чистой культуры
анаэробов.
2.Тестовый контроль. Заполнение
карты №5 «Выделение чистой культуры
анаэробов».
• В. Вопросы для самоподготовки:
• а) Анаэробный тип дыхания
микроорганизмов.
• б) Принципы создания анаэробных
условий.
• в) Особенности питательных сред,
применяемых для культивирования
• анаэробов.

4.

Методы создания анаэробных условий для
культивирования микроорганизмов.
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный
потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в
среде и окружающем ее пространстве.
Это достигается применением
Физических
методов
Химических
методов
Биологических
методов.

5.

Физические методы создания анаэробных условий для
культивирования микроорганизмов.
Основаны на
выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко
окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных
сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых
выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.

6.

В качестве редуцирующих веществ обычно
используют кусочки (около 0,5 г) животных
или растительных тканей (печень, мозг,
почки, селезенка, кровь,
картофель),тиогликолевую
кислоту,тиогликолят натрия,цистеин,глюкозу
и др.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред
производят по способу Виньяль — Вейона, который
состоит в механической защите посевов анаэробов от
кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30
см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают
в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого
конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец
трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с
расплавленным и охлажденным до 50°С питательным
агаром засевают исследуемый материал. Затем
насасывают засеянный агар в стерильные трубки
Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки
запаивают в пламени горелки и трубки помещают в
термостат. Так создаются благоприятные условия для
роста самых строгих анаэробов. Для выделения
отдельной колонии трубку надрезают напильником,
соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают,
а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в
пробирку с питательной средой для дальнейшего
выращивания и изучения в чистом виде
Удаление воздуха производят путем его
механического откачивания из специальных
приборов — анаэростатов, в которые помещают
чашки с посевом анаэробов. Переносный
анаэростат представляет собой толстостенный
металлический цилиндр с хорошо притертой
крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный
отводящим краном и вакуумметром. После
размещения засеянных чашек или пробирок воздух
из анаэростата удаляют с помощью вакуумного
насоса. Замену воздуха индифферентным газом
(азотом, водородом, аргоном, углекислым газом)
можно производить в тех же анаэростатах путем
вытеснения его газом из баллона.

7.

Химические методы создания
анаэробных условий для
культивирования бактерий.
Для связывания кислорода воздуха можно провести в
замкнутом объеме (например, в эксикаторе с
притертой крышкой или аэростате) химическую
реакцию, которая протекает с поглощением
воздуха.
А. В методе Аристовского с этой целью
используются сыпучие ингредиенты. В развитие
этого метода современная микробиологическая
промышленность выпускает специальные наборы, с
помощью которых можно создать газовую смесь, как
с полным отсутствием кислорода, так и с
присутствием его, а также углекислого газа и
азота, в определенных концентрациях, необходимых
для культивирования бактерий с
«нестандартными» требованиями к условиям
аэрации.
Б. В методе Омелянского с этой целью
используются жидкие ингредиенты (пирогаллол и
едкое кали).
ЭКСИКАТОР

8.

Биологические методы создания
анаэробных условий для
культивирования микроорганизмов.
Основаны на совместном выращивании анаэробов со
строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой
пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным
скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается
два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону
агаровой пластинки засевают аэроб, например часто
используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую
сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают
пластилином или заливают расплавленным парафином и
помещают в термостат. При наличии подходящих условий
в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь
кислород в пространстве чашки будет ими использован,
начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях
сокращения воздушного пространства в чашке
питательную среду наливают более толстым слоем.

9.

Питательные среды, используемые для
культивирования анаэробов.
Вильсона — Блера — плотная селективная
питательная среда для анаэробных бактерий,
содержащая сернистокислый натрий и хлорное
железо; анаэробные бактерии образуют колонии
черного цвета в результате образования
сернистого железа.
Среда Китта — Тароцци состоит из
мясопептонного бульона, 0,5% глюкозы и
кусочков печени или мясного фарша для
поглощения кислорода из среды. Перед посевом
среду прогревают на кипящей водяной бане в
течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из
среды. После посева питательную среду сразу
заливают слоем парафина или вазелинового
масла для изоляции от доступа кислорода.

Бактериологический метод исследования. Выделение чистых культур анаэробов

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.