Сложные способы окрашивания: окрашивание по методу Грама

1.

ТЕМА: СЛОЖНЫЕ СПОСОБЫ
ОКРАШИВАНИЯ: ОКРАШИВАНИЕ
ПО МЕТОДУ ГРАМА.
ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ № 5-6

2.

▶ Цель занятия:
Ознакомиться с методами окрашивания по Граму.
▶ Вопросы:
1.
Сущность дифференциально-диагностической
окраски.
2.
Сущность окраски по Граму.

3.

Сложные, или дифференциальные, способы
окраски бактерий основаны на особенностях
физико-химического строения микробной
клетки. Они применяются для детального
изучения структуры клетки (макрокапсулы,
жгутики, цитоплазматические включения и
т.д.), а также для дифференциации данного
микроба от других. Таким образом, сложные
способы
окраски
микробов
являются
необходимым диагностическим методом в
микробиологической практике. При сложном
методе окраски используются два и более
красителей,
а
также
протрава
и
дифференцирующие вещества.

4.

Протравы – физические и химические факторы, обладающие свойствами
повышать окрашиваемость микробов. Уплотняя цитоплазму, они могут делать
окраску более прочной, или усиливать красящие свойства красителя, или
разрыхлять оболочки клеток, спор, способствуя проникновению краски в клетку.
Протравами обрабатывают мазок:
а) перед окрашиванием – воздействуя раствором НCl при окраске спор у бактерий в
методе Ожешки,
б) в момент окраски – фенол и высокая температура (подогревание препарата) в
методе Циля-Нильсена;
в) после нанесения краски для ее закрепления – раствор Люголя в методе Грама.
Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или
структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие. Например: этиловый
спирт в окраске по Граму, серная кислота в методах Циль-Нильсена и Меллера.

5.

Сложные методы окраски
Дифференциальные
Метод Грама – дифференцирует
грамположительные и
грамотрицательные бактерии – важный
таксономический признак
Метод Циля-Нильсена – дифференцирует
кислотоустойчивые и
некислотоустойчивые бактерии –
принципиальное значение в диагностике
туберкулеза
Выявляющие структуры
бактериальной клетки
Метод Мелллера – споры
Метод Михина – капсула
Метод Романовского-Гимзы – биполярная окраска
пастерелл

6.

Метод Грама
Методика окраски по Граму (модификация
Лоурейро)
1. На фиксированный мазок кладут полоску
фильтровальной бумаги
и наливают раствор
генцианвиолета на 3 минуты.
2.Краску сливают вместе с бумажкой (не промывать
водой), наносят на препарат йодированный спирт на
30 секунд.
3.Промывают водой.
4.Дополнительно окрашивают фуксином Пфейфера в
течение 2 мин.
5.Сливают краску, промывают водой, высушивают и
микроскопируют.
Микроскопическая картина:
Грамположительные микробы - темно-фиолетового
цвета.
Грамотрицательные микробы - красного цвета.

7.

Грам положительные
Гр + бактерии
Грам отрицательные
По химическому составу
1.Пептидогликан (муреин) в
клеточной оболочке количество80-90%
Пептидогликан (муреин) в клеточной
оболочке количество-10-20 %
2. Содержат тейхоевые и
липотейхоевые кислоты
Не содержат тейхоевые кислоты
3. Не содержат
Липополисахаридов
Содержат Липополисахариды
По составу
Гр - бактерии
1. Они состоят из одного слоя
Они состоят из трёх слоев
2. Толстый, мягкий, рыхлый
Тонкий, твердый, плотный
Способность прокариот окрашиваться по методу Грама или
обесцвечиваться этанолом обусловлена спецификой химического
состава и ультраструктурой их клеточной стенки. Содержание
пептидогликана — основного компонента клеточной стенки — у
грамположительных бактерий составляет от 50 до 90%, у
грамотрицательных — 10–20%. Структурные микрофибриллы
пептидогликана у грамотрицательных бактерий связаны менее
компактно, поры в их пептидогликановом слое значительно шире,
чем в молекулярном каркасе грамположительных бактерий,
поэтому фиолетовый комплекс генцианвиолета и йода у них
вымывается быстрее.

8.

Метод Циля-Нильсена
Основным способом окраски кислотоустойчивых
микробов является способ Циля-Нильсена.
1. На приготовленный и фиксированный мазок
помещают полоску фильтровальной бумаги и наливают
раствор карболового фуксина Циля.
2. Предметное стекло с мазком и нанесенной краской
подогревают над пламенем спиртовки до появления паров и
краску оставляют на препарате без подогревания еще на 2-3
мин.
3. Затем бумажку удаляют, краску смывают водой 3-5
с.
4. Обесцвечивают 5 %-ным раствором серной кислоты.
5. Промывают спиртом 5-10 с, а затем водой.
6. Докрашивают метиленовым синим 2-3 мин,
промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой.
7. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Кислотоустойчивые микробы окрашиваются в красный
цвет, а фон мазка, в том числе и кислотонеустойчивых
микробов, - в синий.
Кислотоустойчивые –
Mycobacteriumкрасные;
некислотоустойчивые
– Staphylococcus-синие
Кислотоустойчивость микробной клетки связана с особым
химическим составом ее клеточной стенки (КС) – имеет
большое количество липидов (жирных кислот, глико - и
фосфолипидов, восков). КС кислотоустойчивых бактерий
имеет очень низкую проницаемость и поэтому плохо
окрашивается
красителями.
Поэтому
приходится
действовать сильными, концентрированными растворами
красок с применение агентов (карболовая кислота) и
подогреванием (протравливание). Раствор карболовой
кислоты разрыхляет КС и повышает её тинкториальные
свойства. Высокая концентрация красителя и нагревание
усиливает взаимодействие красителя с КС, которая
окрашивается в красный цвет. При последующем
воздействии кислот некислотоустойчивые бактерии
обесцвечиваются и докрашиваются метиленовым синим в
голубой цвет, а кислотоустойчивые остаются окрашенными
фуксином в красный цвет.

9.

Окраска спор по методу Меллера
1. На фиксированный мазок наливают 5 %-ный раствор
хромовой кислоты на 2-4 мин. После протравливания
кислоту смывают водой.
2. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги,
обильно смачивают карболовым фуксином Циля,
подогревают 8—10 мин до появления паров (но не до
кипения). При этом важно, чтобы краситель испарялся,
но бумага не подсыхала. Поэтому периодически
добавляют новые порции краски.
3. Затем бумажку снимают и 5—10 с препарат
обесцвечивают 5 %-ным раствором серной кислоты и
промывают водой. Вегетативные клетки при этом
обесцвечиваются.
4. Препарат дополнительно 2 мин окрашивают
метиленовым синим Лѐффлера.
5.
Мазок
вновь
промывают,
просушивают
фильтровальной
бумагой
и
микроскопируют
с
иммерсией.
Микрокартина:
споры
–
красные;
вегетативные клетки – синие.
Споры малиновые, видны как эндоспоры внутри
вегетативных клеток , так и отдельные споры
Вегетативные клетки синие

10.

Окраска капсул по способу Михина
1. Фиксированный мазок окрашивают раствором
метиленового голубого в течение 2-3 мин,
подогревая до появления паров.
2.
Краску
быстро
смывают
водой,
мазок
подсушивают фильтровальной бумагой. Раствор
метиленового голубого лучше брать давнего
приготовления, поскольку, чем дольше хранится
раствор, тем лучше окрашивается препарат.
3. Капсулы окрашиваются в светло-розовый цвет,
бактерии – в темно синий.
Микроскопическая картина:
Капсула - розовая, бактериальная клетка - синяя.