Мониторинг слизней рода Arion на носительство бактерий Listeria monocytogenes

1.

Мониторинг слизней рода Arion на
носительство бактерий Listeria monocytogenes
Выполнила:
ученица 10 класса
МБОУ «Гимназия №4»
Холоднова Мария Константиновна
Руководитель:
Васильцова Оксана Николаевна
Научный консультант:
Эйдельштейн Инна Александровна,
к.б.н., НИИ антимикробной
химиотерапии

2.

Актуальность работы
Рачевский овраг, Чёртов мост (вид сверху)

3.

Актуальность работы
Зона отдыха внутри оврага
Испанский слизень в ручье
Рачевского оврага

4.

Цель: мониторинг на носительство слизнями рода Arion
бактерии Listeria monocytogenes.
Задачи:
• Изучить биологические и экологические особенности испанского
слизня — Arion vulgaris.
• Определить места обитания слизня на территории города Смоленск.
• Взять пробы слизи и экскрементов слизней Arion vulgaris, обитающих
в Рачевском овраге.
• Исследовать биологические образцы на наличие бактерии Listeria
monocytogenes методом ПЦР.
Гипотеза: в биологических выделениях слизня Arion vulgaris
могут содержаться бактерии Listeria monocytogenes.

5.

Испанский слизень, Arion vulgaris
•Слизень испанский (Arion vulgaris), или слизень дорожный
испанский, или моложень испанский — вид наземных
стебельчатоглазых брюхоногих моллюсков рода арионы
(Arion) семейства арионид (Arionidae)
•Это крупные слизни оранжевого или коричневатого цвета,
реже тёмно-серого или почти чёрного. Их длина может
Испанскийслизень
слизеньвввручье
ручье достигать 120 мм (в отдельных случаях — около 150 мм).
Испанский
Испанский
слизень
ручье
Рачевскогооврага
оврага
Рачевского
Рачевского
оврага
• A. vulgaris долгое время ошибочно принимали за Arion
lusitanicus, описанного из Португалии Жюль Полем
.
Мабилем
в 1868 году.
Испанский слизень в траве

6.

Характеристика бактерии рода Listeria и
листериоза
Листерии — род грамположительных палочковидных бактерий. Некоторые виды
являются возбудителями заболеваний животных и человека. Листерии широко
распространены во внешней среде.
Листерия
(https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1007747)
Наиболее часто причастными к листериозу оказываются следующие пищевые продукты:
•продукты с длительным сроком хранения в холодильнике (при достаточно длительном
хранении при температурах, поддерживаемых в холодильнике, количество
(L. monocytogenes ) в продуктах может значительно увеличиться);
•продукты, потребляемые без последующей обработки, например без тепловой
обработки, которая позволила бы убить L. monocytogenes.

7.

Симптомы листериоза
неинвазивный
инвазивный
•более легкая форма болезни
•более тяжелая форма болезни
инкубационный период —
несколько дней
инкубационный период — от
нескольких дней вплоть до
90 дней
oдиарея
oповышенная температура
oголовная боль
oмиалгия (мышечные боли)
oповышенная температуру
oмиалгия (мышечные боли)
oсептицемия (заражение крови)
oменингит

8.

Сбор биологического материала
Биологический материал был собран в Рачевском овраге, г. Смоленска.
Внутри оврага
Район сбора особей
слизней. Красным
отмечен маршрут
(https://yandex.ru/map
s/-/CCUBA4UY9D

9.

Методика сбора образцов биологического материала
Отловили 5 слизней возле
жилых домов,
расположенных в верхней
части оврага
Стерильным ватным
тампоном собрали слизь с
поверхности слизня, а
самого слизня положили в
банку и плотно закрыли,
оставляя отверстия для
дыхания
Отловили еще 5 слизней в
нижней части оврага вдоль
реки Рачевки через
определенное расстояние и
собрали образцы их слизи

10.

Оставили собранных
слизней на сутки в банках
для получения
экскрементов
Стерильным ватным
тампоном собрали
экскременты слизней и
поместили в стерильные
пробирки

11.

Опыт по выделения ПЦР для определения
листерии.
Метод ПЦР
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод
молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых
концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в
биологическом материале (пробе).
• В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого
участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in
vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для
визуальной детекции. При этом происходит копирование только того
участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том
случае, если он присутствует в исследуемом образце.
• Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже
если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

12.

Методика выделения ПЦР для определения
листерии Listeria monocytogenes
1. Выделение ДНК с помощью ДНК – СОРБ- АМ системой.
Набор реактивов
(https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/
vydelenie-i-ochistka-nukleinovykh-kislot-i-belkov/dnk-sorb-am-komplektreagentov-dlya-vydeleniya-dnk-iz-klinicheskogo-materiala.html)
2. Транспортная среда с муколитиком для растворения слизи
– объем 300 мл
Набор для приготовления транспортной среды
( https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/neyroinfektsii/
amplisens-listeria-monocytogenes-skrin-monitor-fl-vyyavlenie-listeria-monocytogenes.html
)
3. Взбалтывание пробы, отбор 100 мл раствора
4. Обработка исследуемого раствора с использованием набора для выделения ДНК,
с добавлением лизирующего буферного раствора, который растворяет оболочки клеток.

13.

5. Очищение выделенной ДНК (с использованием реагентов, которые входят набор
тест системы)
Набор реагентов для очищения ДНК
(https://nextbio.ru/catalog/transportnye-sredy/amplipraym-tsm/)
6. 10 мл раствора в микропробирке помещаем в прибор амплификатор
Амплификатор детектирующий ДТпрайм
(https://dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/rtamplificators/dt_prime)
7. В прибор устанавливаются 20 микропробирок с подготовленными пробами
8. В приборе пробы находятся 1 ч 45 мин
9. Обработка результатов.

14.

Результат ПЦР по обнаружении Listeria
monocytogenes
Было обработано 10 пробирок с пробами слизи слизня, вторые 10
пробирок — с экскрементами слизня (Приложение).
Вывод: тест-система ДНК рабочая, но канал HEX в таблице не отражает результатов,
значит, в исследуемых пробах слизи и экскрементов в ДНК Listeria monocytogenes
не обнаружено.

15.

Графики проведения ПЦР ДНК – СОРБ- АМ
системой на ДНК Listeria monocytogenes
Канал ROX показал
совпадения ДНК с ДНК
Listeria monocytogenes.
Канал FAM показал
совпадения ДНК с ДНК
Listeria monocytogenes.
Канал HEX не показал
совпадений ДНК с ДНК
Listeria monocytogenes.

16.

Общие выводы
1.
Местные жители, к сожалению, вынуждены терпеть дискомфорт,
проживая на одной территории со слизнями, которые кроме угрозы
заражения опасной инфекцией пугают жителей своим видом и яркой
окраской.
2.
Исходя из этого, проведено исследование на наличие бактерий Listeria
monocytogenes у 10 особей слизней, собранных в районе Рачевского
оврага г.Смоленска возле многоэтажных жилых домов и частных
домовых хозяйств.
3.
Тест-система ДНК рабочая, но канал HEX в таблице не отражает
результатов, значит, в исследуемых пробах слизи и экскрементов в ДНК
Listeria monocytogenes не обнаружено.
4.
Канал HEX не показал совпадений ДНК с ДНК Listeria monocytogenes
Канал FAM показал совпадения с тест-системой ДНК
Канал ROX показал совпадения с тест-системой ДНК.
5.
В перспективе мы собираемся отслеживать распространение слизи на
территории города Смоленска и Смоленского района, в частности, обследовать
Чуриловский овраг города Смоленска.