Действие на импулсно електрично поле върху биологични мембрани.Електропорация

1.

Действие на импулсно електрично поле върху биологични
мембрани.Електропорация.
Упражнение 2 Електроиндуциран лизис на еритроцити.
Влияние на състава на инкубационната среда

2.

Прилагането на импулсно електрично поле може да предизвика клетъчен
лизис (електроиндуциран лизис) при животински клетки и протопласти.
Приема се че, лизисът е:
1.
2.
директен резултат от индуцираните пори/дефекти
колоидно-осмотична хемолиза в резултат от повишаване на проницаемостта на
мембраната за йони
Доказателство за колоидно- осмотичната природа на електроиндуцирания лизис
-
инкубация на порираните клетки в
изоосмотична среда (0.9% NaCl) води до
100% хемолиза.
-
инкубация на порираните клетки в
изоосмотична среда съдържаща NaCl и
захароза (или други молекули с по-голяма
мол. маса) води до значителна протекция
(предпазване от лизис).

3.

Kолоидно-осмотична хемолиза
Упражнение 3 курс
В хипотонична среда:
Навлизане на вода
Увеличаване на обема
Поява на пори/дефекти
Хемоглобин
диаметър 5 нм
Повишване проницаемостта за йони

4.

Захароза - 0,55 nm
Хемоглобин – 5 нм

5.

Упражнение 2 Електроиндуциран лизис на човешки еритроцити.
Влияние на състава на инкубационната среда и температурата.
Клетките се промиват двукратно с 0.9% NaCl, чрез центрофугиране в епп.центрофуга(15 s; 12 000
rpm) и се ресуспендират в изоосмотична среда (0.45% NaCl, 0,154 M захароза).
Условия на електрично третиране – кювети с разтсояние
1. Прилагат се 10 импулса, 0.8 ms, 4 Hz с напрежение : 100,150, 200,
250, 275, 300, 325 V
2. 10 импулса, 4 Hz, напрежение 300 V и продължителност на импулсите
0.2; 0.4; 0.6; 0.8, 1
2 mm

6.

Влияние на състава на инкубационната среда
1. 130 μl кл. суспензия се поставя в кюветата
2. Прилагат се електрични импулси
3. Добавят се 130 μl 0,45% NaCl / 0,15 М захароза
NaCl
4. 20 μl от тази суспензия се ресуспендират в 1,2 ml 0,9 % NaCl (2
повторения)
Или 0,45% NaCl / 0,15 М захароза
Инкубира се 10 min на стайна температура
Определя се OD 690 и се изчислява % хемолиза.

7.

Да припомним
690нм

8.

Лизиране на Еритроцити при Електропорация в
зависимост от Интензитета на полето
%Н Упр.1
%Н Упр.2
100
80
60
% Н 40
20
0
0
500
1000
1500
E (V/см)
2000
2500

9.

Биляна
Райна

10.

%H
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
350 V
300 V
0
2
4
6
8
Продължителност (us)
Йоанна
ХЕМОЛИЗА НА ЕРИТРОЦИТИ
СПРЯМО ПРОМЯНА В
НАПРЕЖЕНИЕТО
100
80
%H
60
40
20
0
-20
0
100
200
300
E (V)
400
500

11.

Биляна
Петрова
Хемолиза на еритроцити спрямо
промяна в напрежението
100
80
%H
60
40
20
0
-20 0
50
100
150
200
250
E (V)
300
350
400
450

12.

Карина