Культуры клеток

1.

Культуры клеток и тканей

2.

3.

4.

Типы клеточных культур культуры
Первичные культуры - свежие, получаемые
из какого-либо органа и существующие до
первого пересева:

5.

Типы клеточных культур культуры
Вторичные (диплоидные) культуры – получены в
результате пересева первичных:
1) сохраняют исходный диплоидный набор хромосом 20-50
генераций, затем трансформируются в анеуплоидные,
гибнут или становятся постоянными;
2) последовательное субкультивирование первичных клеток
приводит к созданию новых клеточных линий - с течением
времени преобладают клетки с наибольшей способностью к
росту.
Эмбриональные фибробласты легкого WI-38

6.

Типы клеточных культур культуры
Постоянные
культуры
(непрерывные
клеточные
линии)
способны
к
неограниченному
количеству
генераций,
анеуплоидные, теряют многие черты клетокдоноров:
- не имеют предела числа делений, что
позволяет наращивать их в неограниченном
количестве;
- в связи с быстрым ростом поддержание
культуры
требует
пассирования,
возраст
культуры считают по числу пассажей.
Линия клеток рака шейки матки HeLa

7.

Постоянные клеточные культуры:
иммортализированные клетки
Иммортализованные клетки
- если конечная клеточная линия
претерпевает
трансформацию
и
приобретает
способность
продолжать
делиться,
она
трансформируется в непрерывную
клеточную линию;
трансформация или мутация
могут происходить естественным
путем, либо быть вызваны вирусами
или химическими веществами, либо
возникать в результате внедрения
клеточных культур в раковую ткань.
Образование гибридом в результате слиянием клонов
лимфцитов с миеломными клетками. Результат –
непрерывная клеточная линия, продуцирующая
моноклональные антитела

8.

Типы клеточных культур:
способы выращивания
Монослойные
(адгезионные)
культуры – культивирование клеток в
виде одного слоя, прикреплённого к
какой-либо
поверхности,
другим
клеткам,
либо
специально
обработанному
искусственному
субстрату.

9.

Типы клеточных культур:
способы выращивания
Суспензионные культуры – тип клеточной
культуры, в которой отдельные клетки или их
небольшие
агрегаты
функционируют
и
размножаются в питательной среде.
Культура клеток почки человека
на магнитном микроносителе
Монослойное
культивирование
на
микроносителях
O микроносители – мелкие твердые
частицы, поддерживаемые во взвешенном
состоянии благодаря перемешиванию.
O на поверхности микроносителей клетки
растут в виде монослоя.

10.

Типы клеточных культур:
способы выращивания
Объемное культивирование (3D культура клеток)
- искусственно созданная среда, в которой клетки
растут и взаимодействуют с окружающей средой во
всех трех измерениях.
Сфероиды –
шарообразные
агрегаты из клеток
Бескарскасные
Карскасные

11.

Системы для культивирования клеток

12.

13.

Органотипические культуры
В
органотипических
культурах
совместно
культивируется
несколько
типов
клеток
• Модели кожи – наиболее продвинутие
органотипические
системы
(живой
эквивалент кожи – ЖЭК)
• ЖЭК
–
тканевая
трехмерная
конструкция,
состоящая
из
слоя
кератиноцитлов и лежащего под ним
слоя ФБ, погруженных в матрицу,
имитирующую внеклеточный матрикс

14.

Окрашивание клеток
Препараты для микроскопирования окрашивают
органическими
красителями.
Красители
поступают в продажу в виде сухих порошков. В
лаборатории сначала готовят насыщенные
спиртовые растворы красителей, а потом из
насыщенных растворов готовят разведенные
(рабочие) растворы.

15.

В основе окрашивания клеток и тканей
лежат
физико-химические
процессы
(диффузия,
адсорбция,
абсорбция,
растворимость и др.), происходящие как
в красителе, так и в микроструктурах.
Большое значение имеют плотность ткани
и
дисперсность
красителя,
которые
определяют
последовательность
и
скорость окрашивания.

16.

Универсальных фиксаторов, одинаково
пригодных для любых целей, не существует
Выбор фиксирующего раствора основывается на
его преимуществах и недостатках для работы с
конкретным видом материала и пригодностью
для конкретного метода микроскопического
исследования.
ацетон
формальдегид
спирты
(этанол, метанол)
пикриновая
кислота

17.

Красители
Основные
Основные,
или
ядерные,
красители – это основания
или
их
соли,
которые
окрашивают структуры кислой
природы
(хроматин
ядер,
ядрышко и др.) и называются
базофильными (гематоксилин,
тионин, кармин, метиловый
зеленый и др.).
Кислотные
Кислотные красители – это
кислоты или их соли, с
помощью которых выявляют
вещества
и
структуры
основной
природы
(цитоплазматические
структуры клеток, эритроциты
и т.д.). Например, эозин,
кислый
фуксин,
конго
красный, эритрозин.
Нейтральные красители
Нейтральные
красители
получают путем комбинирования
основных
и
кислотных
красителей. Поскольку основной
краситель окрашивает ядра, а
кислотный
—
цитоплазму,
нейтральный краситель будет
окрашивать как ядра, так и
цитоплазму
(эозинат
метиленового синего и краситель
Гисма).

18.

Процесс гистологического окрашивания
Прогрессивной
окраской
называют такую, при которой
после
красочной
ванны
достигается
интенсивное
проникновение красителя в
ткань.
Регрессивная окраска – при
которой
объект
сначала
приобретает
чрезмерно
плотное
окрашивание,
которое затем ослабляют до
желаемого тона.
Если
раствор
красителя
непосредственно действует на ткань, то
говорят о
прямом окрашивании. Окрашивание
после
предварительной
подготовки
ткани
(протравливания)
называется
непрямым.
Окрашивание одним красителем
– простое, при использовании
нескольких
красителей
–
сложное.
Кровеносный сосуд в почке.
Окраска орсеином.
Эластичные волокна – от красного до
коричневого цвета
Мышечная оболочка тонкой кишки (метод Ван Гизона):
1 – соединительная ткань – красная;
2 – мышечная ткань – желтая, ядра – буро-черные

19.

Гематоксилин
–
краситель
растительного происхождения.
Содержится в форме гликозида в
соке кампешевого дерева.
Химическая формула гематоксилина (а) и гематеина (б)
Эозин – (тетрабромфлюоресцеин) – красный
кислый краситель, получаемый в результате
реакции брома с флюоресцеином и
флюорохром зеленовато-желтого цвета.
Химическая формула эозина В
Растворим в воде и
этаноле и применяется
для окраски цитоплазмы
и ее структур.

20.

Витальная окраска клеточных культур
дает возможность выявлять изменения, происходящие
в клетках и тканях при разных внешних воздействиях.
Разница в количестве красителя, поглощенного
неповрежденными и поврежденными клетками,
свидетельствует о характере и степени изменений,
возникающих под влиянием различных внешних
воздействий
По оптическим свойствам
различают витальные
красители для видимого
света и
флуоресцентные
красители
(флуорохромы).
По химическим свойствам различают
основные и кислотные (кислые)
витальные красители.

21.

Метод
витальной
окраски
с
использованием
трипанового
синего – это контроль за состоянием
проницаемости
плазматической
мембраны клеток.
Химическая формула трипанового
синего
Неповрежденные
мембраны
непроницаемы
для
трипанового синего при кратковременной инкубации;
при этом даже небольшие включения красителя в
цитозоле свидетельствуют о нарушении интактности
клеточной мембраны.
Для
визуальной
оценки
повреждения
клеток
используется
способность
ядерных
белков
адсорбировать краску.
Даже самое слабое окрашивание ядра является
индикатором повреждения клеточной мембраны.

22.

1) Суспензию живых клеток смешивают со
свежепрофильтрованным
0,5%
раствором
трипанового синего в PBS.
2) Полученный раствор переносят в камеру
Горяева
и
выполняют
подсчет
количества
окрашенных и неокрашенных клеток в 25
заштрихованных
квадратах
(стандартным
способом).
Жизнеспособность
клеток
(ЖК)
определяют по формуле:
3) Количество жизнеспособных клеток на 1 мл
культуры определяют по формуле:
В квадрате считаются клетки, лежащие внутри его, а
также касающиеся левой и верхней границ. Клетки,
касающиеся правой и нижней границ при подсчете не
учитываются.