Определение активности ферментов

1.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Гильмутдинова Эльмира, МТБ01-23-01

2.

Ферменты, энзимы – биокатализаторы белковой природы (или РНК рибозимы),
образующиеся в живых клетках и обладают способностью активировать различные
химические соединения.
Активность
ферментов
характеризуется
катализируемой скоростью:
○ превращения субстрата
○ накопления продукта реакции
При
оптимальных
условиях
температуры, рН среды и полном
насыщении фермента субстратом
скорость
катализируемой
реакции
пропорциональна
концентрации фермента.
Единица активности (Е) – количество фермента, катализирующее превращение одного
микромоля субстрата в 1 мин при стандартных условиях (мкмоль/мин). Существует
другая единица активности: 1 катал (kat) — количество фермента, который
катализирует превращения 1 моля субстрата в 1 секунду. 1 Е фермента = 16,67 нкатал.
Удельная активность – это число единиц активности (Е) на мг белка.
Число оборотов фермента, или молярная активность — количество молекул субстрата,
превращаемых одной молекулой фермента в продукт в единицу времени.
2

3.

ПРОБЛЕМЫ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА
1) Часто шум и реакция демонстрируют
небольшую
разницу
в
сигналах,
особенно когда происходят только
небольшие
молекулярные
модификации,
как
во
многих
изомеразных реакциях. Интенсивность
сигнала,
отображаемого
реакцией,
должна превышать шум как минимум в
два раза.
2) Невозможно соблюдать одни и те же
оптимальные
условия
для
всех
ферментов. Общих стандартов для
определения активности ферментов нет.
3) Кроме оптимальных условий, могут
иметь
место
и
другие
влияния
соединений,
не
участвующих
непосредственно в реакции:
● взаимодействия ионов, особенно
ионов металлов
● гидрофобных веществ
● детергентов с поверхностью белка.
https://doi.org/10.1016/j.pisc.2014.02.005
3

4.

ПРОБЛЕМЫ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА
4) Методы непрерывного
определения
активности
достовернее
для
количественного
анализа,
т.к.
при
методах
с
прерывным
определением
измеряемые данные могут
не попасть в линейную
область (желтым цветом)
кривой хода ферментативной
реакции.
Скорость
определяется
наклоном линии (в идеале 5%
конверсии продукта)
https://doi.org/10.1016/j.pisc.2014.02.005
4

5.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Спектрофотометрический
Колориметрический
Флуорометрический
Химический
Манометрический
Поляриметрический
Потенциометрия
Хроматографический
Ядерный магнитный резонанс
…
5

6.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
Непрерывный, недорогой и нетрудоемкий метод.
Измерение по появлению или исчезновению окрашенного соединения на
колориметре или фотометре.
Может использоваться УФ-диапазон.
Если спектрофотометрия неэффективна, применяют флуоресценцию на
спектрофлуориметрах в 96-луночном черном планшете, однако подобный подход
уместен для определения активности не всех ферментов.
Для мутных растворов применяют нефелометрию (измерение рассеяния) и
турбидиметрию
6

7.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
Выявляют оптимальную
длину волны для
измерения
Из пробы удаляются
клетки
https://doi.org/10.1016/j.ab.2005.05.032
7

8.

РАДИОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Ферментный
субстрат
известного
объема,
содержащий радиоактивный изотопный атом
(или радиоизотоп) в положении, которое
подвергается переносу.
Излучение бета-частиц дает чувствительное
определение количества радиоактивности в
образце, которое непосредственно измеряется в
количестве импульсов в минуту (cpm).
Определение излучения происходит с помощью
люминесценции
или
тонкослойной
хроматографии.
doi:10.1021/acs.jmedchem.1c00096
Удельная активность относится к количеству
радиоактивности (cpm) на единицу количества
молекулы (моль).
8

9.

МАНОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Один из
состоянии.
компонентов
находится
в
газообразном
К рассматриваемым реакциям относятся: окисление и
декарбоксилирование.
Наблюдение за ходом реакции во времени проводится в
специальных приборах - манометрических аппаратах
Варбурга
Регистрируются изменения газового давления, которые
наступают в среде при постоянном объеме и температуре.
Непрерывный метод, позволяющий составить кривую.
https://agro-archive.ru/metody-issledovaniya/130-apparat-varburga.html
9

10.

ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Применяется только для изометрических
энзимов, локализованных в цитоплзаме.
Основан на измерении угла вращения
плоскости
поляризации
света
при
прохождении его через оптически активные
вещества, что обусловлено присутствием в
молекуле этих веществ асимметричного
атома углерода.
Вызывается
вращение
плоскости
поляризации света вправо (D или +) или влево
(L или -).
Поляриметр
Удельное
вращение
плоскости
поляризованного луча света при
оптимизированных
условиях
является постоянной величиной.
10

11.

Пример:
Активность
глутаматрацемазы
с
использованием L-глутамата в качестве
субстрата.
В
пробу
добавляли
субстрат,
перемешивали, помещали в кювету и
измеряли в течение времени оптическое
вращение.
doi:10.1021/ac035012s
На основании начальных определений скорости и максимального потребления 50% LGlu было подсчитано, что 1° соответствует 0,41 мкмоль L-Glu.
Удельная активность:
11