Основы микробиологии и иммунологии

1.

Основы микробиологии и
иммунологии
МОМК №2, Остапова Т.С., 2016 г.
1

2.

Входной контроль
1.
1 вариант
2 вариант
Факторы патогенеза данной реакции – Ig E, Ig
G4, прикрепленные на поверхности тучных
клеток, аллергены – экзогенные.
Образующийся иммунный комплекс не
может свободно циркулировать с
кровотоком. Патогенез реализуется через
высвобождение гистамина, серотонина,
кининов и др. медиаторов.
Факторы патогенеза данной реакции – Ig M,
Ig G, аллергены свободные, экзогенные (в
растворимой форме). Образующийся
иммунный комплекс свободно циркулирует
в кровотоке, откладываясь на базальных
мембранах, эндотелии и т.п., где происходит
активация комплемента и фагоцитов,
приводящие к повреждению тканей
организма.
А)Анафилактический (реагиновый) тип аллергической реакции
Б)Цитотоксический тип аллергической реакции
В)Иммунокомплексный (тип Артюса) тип аллергических реакций
Г) Клеточно-опосредованный тип аллергических реакций
2.
Иммунный процесс протекает по единой
схеме и состоит из нескольких этапов,
перечислите их по порядку.
В течении специфических аллергических
реакций различают несколько стадий,
перечислите их по порядку.
3.
По 2-му типу аллергических реакций
протекают:
По 1-му типу аллергических реакций
протекают:
А)Феномен Артюса
Б) Поллинозы
В) Анафилактические реакции на ужаления насекомых
Г) Гемолитическая болезнь новорожденных при резус-конфликте

3.

Проверим себя:
1 вариант
2 вариант
1.
А – анафилактический (реагиновый)
тип
В – иммунокомплексный тип
2.
1 этап – попадание Аг извне или
образование внутри организма. 2 этап –
распознавание антигена как
чужеродного. 3 этап – включение
комплекса защитных реакций
специфического и неспецифического
характера. 4 этап – обезвреживание,
элиминация антигена и приобретение
организмом нового иммунного
состояния (невосприимчивость,
толерантность, иммунологическая
память, аллергия).
I стадия — иммунологическая;
II стадия — патохимическая, или
образования медиаторов;
III стадия — патофизиологическая, или
стадия клинического проявления
повреждения.
3.
Г - Гемолитическая болезнь
новорожденных при резусконфликте
Б- Поллинозы
В- Анафилактические реакции на
ужаления насекомых

4.

Иммунодиагностические реакции
Иммунный статус
Лекция

5.

План лекции:
1. Иммунодиагностические реакции (реакция
антиген-антитело): агглютинации и
преципитации. Реакции лизиса. РИФ, ИФА,
РИА, иммуноблотинг.
2. Иммунный статус: общее клиническое
обследование, оценка факторов
естественной резистентности, гуморального
иммунитета, клеточного иммунитета.
3. Тесты I уровня
4. Тесты II уровня
5. Иммунодефициты

6.

Иммунодиагностика
• Иммунодиагностика - раздел иммунологии,
изучающий и разрабатывающий методы
распознавания инфекционных и неинфекционных
болезней.
• Иммуномикробиологические исследования - вид
микробиологического экспресс-анализа по
выявлению специфических антител и антигенов.
• В основе иммунологических методов лежат
серологические реакции, для постановки которых
используют сыворотку (serum), содержащую
антитела (основаны на взаимодействии антигенов и
антител) и клеточные реакции, базирующиеся на
взаимодействии антигенов (аллергенов) с Тклетками.

7.

Серологические реакции иммунитета (АГ+АТ)
Характеризуются следующими свойствами:
1) специфичность - способность АГ (АТ)
вступать в реакцию только с соответствующим
АТ (АГ).
2) чувствительность - минимальное количество
АГ или АТ, которое выявляет данная реакция.
Любую реакцию иммунитета можно
представить:
АГ+АТ=иммунный комплекс (РЕЗУЛЬТАТ)

8.

Области применения реакций иммунитета:
• медицина, фармация, санитарноветеринарная служба, трансплантация
органов и тканей (в т.ч. крови), судебная
медицина.

9.

Применение
иммунологических методов в медицине:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного
статуса).
Определение состава и характеристик тканей человека: групп
крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.
Диагностика инфекционных болезней и устойчивости к ним по
обнаружению и установлению титров антител
(серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в
организме, определению клеточных реакций на эти антигены.
Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных
из организма человека и животных.
Выявление в организме человека и во внешней среде любых
веществ, обладающих антигенными или гаптенными
свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и
т.п.).
Выявление иммунопатологических состояний, аллергий,
трансплантационных и противоопухолевых реакций.

10.

Иммуноиндикация
• метод диагностики, имеющий целью
обнаружение в исследуемом материале
микробных АГ:
х АГ+АТ= иммунный комплекс-результат
(например, ИФА)
• Стандартными диагностическими
препаратами являются иммунные сыворотки
(агглютинирующая) или антительные
диагностикумы (эритроцитарные), т. е.
эритроциты, сенсибилизированные антителами.

11.

Серодиагностика
?
• метод, целью которого является
обнаружение в сыворотке (или слюне)
обследуемого неизвестных АТ:
АГ + х АТ=иммунный комплекс-результат
• АТ могут быть разного происхождения постинфекционные, инфекционные и др.
• Правила забора крови для
иммунологического исследования: этот
метод используют на 2-ой неделе
заболевания; кровь берут из локтевой вены
в количестве 5-6 мл. натощак, соблюдая
правила асептики.

12.

Фазы реакций иммунитета:
иммунологическая - специфическая (невидимая).
Комплекс АГ+АТ образуется быстро.
1. специфическая - фаза взаимодействия, в которой
происходит комплементарное соединение
• активных центров антител (паратопов) и
• эпитопов антигена.
Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;
2. физико-химическая - неспецифическая (видимая).
При прямых осадочных реакциях комплексы
укрупняются и выпадает осадок АГ+АТ, но для этого
необходим электролит (физиологический раствор).

13.

Реакция агглютинации (РА)
• Реакция агглютинации - происходит склеивание корпускулярных АГагглютиногенов, под действием АТ - агглютининов, что проявляется
образованием осадка.
• Агглютинат - это комплекс АГ+АТ.
• Положительный результат реакции агглютинации характеризуется большей
или меньшей прозрачностью жидкости и осадком микробов на дне
пробирки. При отрицательном результате жидкость сохраняет
первоначальный гомогенный вид.
• Характер агглютинации, т. е. тип образующегося агглютината, может быть
разнообразным. Образование крупных хлопьев, оседающих на дно
пробирки, характерно для крупнохлопчатой (Н)-агглютинации, наступающей
в результате склеивания бактериальных клеток посредством жгутиков, и
происходит в течение 2 часов пребывания пробирки в термостате.
• О-агглютинины обусловливают склеивание микробных тел, дающее
компактный мелкозернистый осадок, выстилающий дно пробирки.
Мелкозернистая (О)-агглютинация протекает медленнее и учитывается
через 24 часа (после 2-часового пребывания в термостате и 18—20часового выдерживания при комнатной температуре) .
• Учет результатов производится невооруженным глазом при чтении
крупнохлопчатой Н-агглютинации и с помощью лупы или агглютиноскопа
при выявлении мелкозернистой О-агглютинации.

14.

Способы постановки РА:
1. Развернутая классическая реакция - объёмный
метод в пробирках часто используют для определения
у больного АТ. К разведениям сыворотки больного
добавляют диагностикум, т.е. взвесь убитых
микроорганизмов (известный АГ).
2. Ориентировочная реакция - пластинчатый метод,
ставят на предметном стекле. К капле
диагностической иммунной сыворотки в разведении
1:10, 1:20 добавить чистую культуру возбудителя
(известный АГ). Если появляется хлопьевидный
осадок, ставят развёрнутую реакцию.

15.

РА на стекле для определения вида микроба – реакция иммуноиндикации (поиск
неизвестного АГ).
1. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят с помощью
пастеровской пипетки 2 капли агглютинирующей сыворотки (с известными АТ).
2. В сыворотку вносят исследуемую бактериальную культуру.
3. Внесенную культуру тщательно перемешивают. Реакция протекает при
комнатной температуре. Результат учитывают с помощью лупы через 5—10 мин.
При положительной реакция в капле отмечается образование осадка в виде
зернышек или хлопьев – его образуют иммунные комплексы АГ+АТ.

16.

Способы
постановки РА
(развёрнутая)
Серодиагностика (ищем АТ). В штатив устанавливают ряд агглютинационных пробирок. На
первой пробирке ряда пишут наименование антигена, который будет введен в реакцию, и
указывают номер исследуемой сыворотки. На каждой пробирке ряда обозначают степень
разведения находящейся в ней сыворотки. Две последние пробирки ряда предназначены
для контроля антигена и сыворотки. На них ставят условные обозначения: КА — контроль
антигена и КС — контроль сыворотки. Степень положительной реакции обозначается по
четырехкрестной системе:
а) (++++)— жидкость в пробирках прозрачна, очень большой осадок в виде зонтика —
полная агглютинация;
б) (+++) — жидкость почти прозрачна, осадок значительный — почти полная агглютинация;
в) (++)— жидкость непрозрачная, осадок небольшой — слабая агглютинация;
г) (+)— жидкость непрозрачная, осадок незначительный, едва заметный невооруженным
глазом; при взбалтывании можно увидеть хлопья или зернистость в лупу или агглютиноскоп
— отмечаются следы агглютинации.

17.

В качестве примера приводим трактовку результата РА на
бруцеллез с сывороткой крови крупного рогатого скота (или
собак), используем диагностикум с известными АГ (бруцелл):
• За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в
котором произошла агглютинация не менее чем на два плюса (++).
• Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с
сывороткой крупного рогатого скота с оценкой не менее чем два
плюса (++) в разведении 1:100 и выше.
• Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в
разведении 1:50 с сыворотками крупного рогатого скота с оценкой не
менее чем на два (++).

18.

Применение РА
РА используют для определения групп крови - реакция Кумбса (антиглобулиновый тест
для выявления антирезусных АТ), для определения АТ в сыворотке крови больных при
брюшном и паратифе – реакция Видаля, бруцеллёзе – реакция Хеддельсона
(агглютинация на стекле) и Райта - информативный показатель (диагностический титр 1 :
160 и выше), при сыпном тифе – ранее применялась реакция Вейля-Феликса (реакция
агглютинации с диагностикумами из штаммов протея* OX19, OX2 или OXK, особенно
значима при нарастании титра антител в ходе болезни), при туляремии (антигеном в
реакции агглютинации служит туляремийный диагностикум). Для идентификации
микроорганизмов, а также для определения серотипов микроорганизмов: используют
для этого агглютинирующие диагностические сыворотки и типоспецифические
(монорецепторные) сыворотки соответственно.
Агглютиноскоп
Представляет собой литую станину (7) с горизонтально расположенной
вверху трубкой-тройником (2) и с гнездами для пробирок. Сверху
горизонтальной трубки над смотровым окном расположено гнездо с
окуляром (3) в виде подвижной короткой трубки с двояковыпуклой
линзой, имеющей фокусное расстояние 36 мм и увеличение в 7 раз. На
вилке, прикрепленной внизу стойки, установлено круглое зеркало (4),
фиксируемое под определенным углом наклона, для направления
пучка света в смотровое окно. К трубке прикреплен на оси подвижный
затемнитель (5), устраняющий посторонние блики.
При пользовании агглютиноскопом в гнезде горизонтальной трубки
помещают пробирки с исследуемой жидкостью и, отрегулировав
освещение зеркалом и затемнителем, путем вращения окулярной
трубки в ту или другую сторону получают резкое изображение объекта
в поле зрения (образовавшиеся хлопья, мельчайшие частицы).

19.

Реакция Видаля (развернутая реакция агглютинации)
ставится в 4 рядах пробирок с разведениями
исследуемой сыворотки (неизвестные АТ) с 4-мя
диагностикумами:
Бр.Т.О. (брюшнотифозный О-диагностикум),
Бр.Т.Н. (брюшнотифозный Н-диагностикум);
а также диагностикумы к Salmonella paratyphi A,
S.paratyphi B – О- и Н- диагностикум соответственно.
Положительным результатом у людей, не привитых
против брюшного тифа, считают агглютинацию в
разведении 1:100 при наличии клинической картины
и не ниже 1:200 при отсутствии таковой. У привитых
больных указанные титры О-антител не являются
надежным диагностическим признаком.
Диагностический титр Н-антител у ранее привитых
больных должен быть не менее 1:400.
Однако абсолютная высота титра агглютининов не
может быть достоверным доказательством наличия
заболевания. Специфический инфекционный
характер реакции агглютинации выявляется только в
динамике по нарастанию титра агглютининов.
В ответе указывают: "Реакция Видаля с
брюшнотифозными, паратифозными
диагностикумами отрицательная" или "Реакция
Видаля с брюшнотифозным (или другим
салмонеллезным серотипа...) диагностикумом дала
положительный результат до титра 1: -".

20.

Развёрнутая реакция агглютинации

21.

Реакция непрямой (пассивной)
гемагглютинации (РНГА, РПГА)
Реакция ставится: 1) для обнаружения полисахаридов, белков,
экстрактов бактерий и других высокодисперсных веществ,
риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в
обычных РА увидеть не удается, или 2) для выявления антител в
сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и
мельчайшим микроорганизмам.
Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию,
в которой используют эритроциты или нейтральные синтетические
материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых
сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или
антитела. Их агглютинация происходит при добавлении
соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты,
сенсибилизированные антигенами, называют антигенным
эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и
титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные
антителами, называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными
диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

22.

РНГА применяется
Для диагностики инфекционных болезней, вызванных
бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия,
бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и
вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный
гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская
геморрагическая лихорадка и др.), определения
гонадотропного гормона в моче при установлении
беременности, выявление повышенной чувствительности
больного к лекарственным препаратам и гормонам,
например пенициллину и инсулину.
Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации
(РНГА, РПГА) — одна из наиболее чувствительных
серологических реакций.

23.

24.

РНГА с ПАРНЫМИ* сыворотками. Наблюдается нарастание титра антител во 2й сыворотке в 4 раза. Это является подтверждением заболевания.
В разведениях, где есть антитела, образуется ЗОНТИК
(эритроцит.диагностикум не может осесть на дно лунки). Где антител нет образуются ПУГОВКИ (эритроцитарный диагностикум оседает на дно лунки).
*когда кровь берут у одного исследуемого дважды через определенный
промежуток времени, и о заболевании судят не по абсолютным показателям,
а по динамике.

25.

Постановка РНГА
• В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные
разведения исследуемого материала (ищем антиген). Затем в
каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости
реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с
эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой
специфичности.
• Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая
внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного
диска или кольца (пуговки) на дне лунки, при положительной
реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая
пленка с неровными краями.

26.

Реакция преципитации – РП
Осаждение комплекса АГ+АТ происходит в результате
соединения растворимого АГ со специфическим АТ.
Осадок - преципитат образуется в виде мутного «кольца».
Реакция широко применяется в судебной медицине.
Используется как качественный, так и количественный
анализ (реакция Манчини). Очень чувствительная реакция
для определения антигенов. С помощью РП также
определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий.
1. Реакция кольцепреципитации – в пробирке путём
наслоения раствора АГ на иммунную сыворотку, при
оптимальном соотношении которых на границе этих
растворов образуется непрозрачное «кольцо» - преципитат.
Применяется в суд.мед. экспертизе.
2. Реакция термопреципитации - для диагностики
сибирской язвы, для иммунной индикации, если в качестве
АГ выступают водные экстракты тканей или органов.

27.

Реакция кольцепреципитации
отрицательная
положительная

28.

29.

Реакция преципитации в геле
Основная функция геля – локализация преципитата.

30.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони
В реакции
преципитации по
Оухтерлони в геле
диффундируют два
компонента. Поэтому
этот метод еще
называют двойной
иммунодиффузией.
Из лунок антиген и
антитела диффундируют
в питательную среду,
вступают в иммунную
реакцию и образуют
полосы преципитации.
В лунках E и G,
содержащих Аг,
произошла реакция с
иммунной сывороткой,
содержащейся в лунке А
(Ат).

31.

32.

Реакция радиальной
иммунодиффузии по
Манчини
Используются моноспецифические
антисыворотки и эталон с известным
содержанием антигена. Тест-антиген и
разведения растворов, исследуемых на
наличие данного антигена, помещают в лунки,
вырезанные рядами в пластине геля, куда
предварительно внесена соответствующая
моноспецифическая антисыворотка. Антиген
диффундирует в гель и, соединившись со
специфическими антителами, формирует
кольца преципитации, диаметры которых
зависят от концентрации антигена в лунках.
Полученные результаты используют для
построения калибровочной кривой,
выражающей зависимость диаметров
преципитантов от концентрации антигена в
исследуемых растворах.
Для изучения токсигенности бактериальных
культур и отбора из бактериальной популяции
клонов с высокой степенью токсичности: в
этом случае исследуемые культуры засевают в
чашки с агаром, содержащим
антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных
колоний образуются кольца преципитации,
диаметр которых прямо пропорционален
степени токсичности штамма
Реакцию также используют для определения
в сыворотке крови иммуноглобулинов
различных классов, компонентов системы комплемента и др.

33.

34.

Реакция
преципитации:
А – реакция
кольцепреципитации;
Б - реакция
преципитации по
Оухтерлони.
3. Реакция двойной иммунодиффузии по
Оухтерлони в агаровом геле для определения
токсигенности дифтерийных палочек.
4. Реакция радиальной иммунодиффузии по
Манчини для определения содержания в крови
иммуноглобулинов разных классов.
5. Иммуноэлектрофорез – сочетает метод
электрофореза и реакцию преципитации.
6. Реакция флокулляции (от лат . flоecus - хлопья
шерсти) – появление хлопьевидной массы или
опалесценции при реакции токсин-антитоксин.

35.

Реакция иммуноэлектрофореза
Смесь антигенов вносится в лунки геля и
разделяется в геле с помощью электрофореза,
затем в канавку параллельно зонам
электрофореза вносят иммунную сыворотку,
антитела которой диффундируют в гель и
образуют в месте "встречи" с антигеном линии
преципитации.
Прибор
иммуноэлектрофоретический ПИЭФ1 предназначен для определения
антигенов и антител при
серологической диагностике
вирусного гепатита и проведения
других иммунологических
исследований (клещевого
энцефалита, менингококковой
инфекции и др.).

36.

Реакция иммуноэлектрофореза
А
Б
В
Г
Метод разработан в 1953 году Грабарем и Вильямсом,
широко применяется в настоящее время для исследования антигенной структуры
многокомпонентных систем

37.

Реакция нейтрализации - РН.
АТ иммунной сыворотки
способны нейтрализовать
повреждающее действие
микроорганизмов или их
токсинов на чувствительные
клетки ткани, это связано с
образованием комплексов АГ+АТ.
Используют для определения
типа ботулинического токсина,
возбудителя газовой гангрены и
т.д. Смесь токсинов и
антитоксической сыворотки
вводят белым мышам, если они
соответствуют друг другу
(нейтрализуются), то мыши не
погибают.
Реакция нейтрализации вирусов:
а — на культуре клеток; 6 — на
курином эмбрионе; в — в
организме животных

38.

Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток:
А - цитопатогенный эффект (ЦПЭ) или цитопатогенное действие (ЦПД) в результате
размножения вирусов;
Б - ЦПЭ отсутствует в результате предварительной нейтрализации вирусов
антителами

39.

Способы проведения РН.
1. Разводят, т.е. титруют взвесь или исследуемый материал и
соединяют их с определенной дозой иммунной сыворотки.
Избыток АГ на нейтрализацию АТ не влияет.
2. Постоянную определенную дозу АГ соединяют с разными
дозами иммунной сыворотки, нейтрализующая сила
сыворотки определяется в АЕ – антитоксических единицах.
Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности АТ
связывать различных возбудителей или их метаболиты,
лишая тем самым их возможности реализовать свои
биологические свойства (иными словами, АТ нейтрализуют
возбудителей). На практике РН применяют для выявления
вирусов и различных токсинов.

40.

Реакция лизиса
(иммунный цитолиз) - РЛ.
• Иммунный лизис - это растворение клеток под
воздействием антител при обязательном
участии комплемента
1) Реакция бактериолиза при диагностике
холеры. Результат наблюдают в пробирке или
организме животного – феномен Исаева.
2) Реакция гемолиза при воздействии на
эритроциты специальной, иммунной по
отношению к ним сыворотки, в присутствии
комплемента наблюдается их растворение –
гемолиз («лаковая» кровь).

41.

Для реакции лизиса необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка
больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела,
участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины,
способствующие лизису эритроцитов; клеток – цитолизины.
3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских
свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно
используют в качестве комплемента. Свежий (нативный)
комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании,
встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не
дольше двух дней после получения. Для консервации
комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата
натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух
недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед
употреблением его растворяют в изотоническом растворе до
первоначального объема (указан на этикетке).
4. Изотонический раствор.

42.

Гемолиз, как и бактериолиз, происходит при
участии специфического антитела и
комплемента. Реакция гемолиза состоит в том,
что при воздействии гемолитической сыворотки
на соответствующие эритроциты в присутствии
комплемента получается их растворение
(гемолиз), взвесь эритроцитов превращается в
ярко-красную прозрачную жидкость — так
называемую лаковую кровь.
В отличие от гемолиза эритроцитов,
получаемого каким-либо другим путем
(например, действием на эритроциты
дистиллированной воды, микробного яда и т.
д.), действие иммунной гемолитической
сыворотки строго специфично, т. е. она
вызывает гемолиз только тех эритроцитов,
которые были взяты для иммунизации. Реакция
гемолиза благодаря своей наглядности получила
широкое применение как вспомогательная
реакция при постановке серологических
диагностических реакций (реакция связывания
комплемента Борде—Жангу, реакция
Вассермана).
Реакция
гемолиза:
а — гемолиз эритроцитов отсутствует;
б — полный гемолиз эритроцитов.

43.

РСК - реакция связывания
комплемента.
В её состав входят две системы:
1) Бактериальная, состоящая из АГ+АТ, в которую
вносится комплемент.
2) Индикаторная гемолитическая система,
включающая эритроциты барана или свежей
сыворотки крови морской свинки, содержащую АТ к
ним.
Если в первой системе АГ+АТ соответствуют друг другу,
то они образуют комплекс в присутствии комплемента,
а в индикаторной системе изменений не происходит и
негемолизированные эритроциты осядут на дно
пробирки.
Результат положительный (у больного) при
отсутствии гемолиза.

44.

Схема реакции связывания комплемента.
а — реакция положительная; б — реакция
отрицательная.
Результат реакции обозначается или словами
«положительная», «отрицательная» реакция, или
знаком плюс (+) или минус (-). Но так как степень
задержки гемолиза может колебаться в пределах
от полной задержки до очень слабой,
обозначения могут быть следующие:
(++++)—полная задержка гемолиза; жидкость не
окрашена, значительный осадок эритроцитов;
(+++) —ясная задержка гемолиза; жидкость
окрашена, осадок эритроцитов;
(++)—частичная задержка гемолиза; жидкость
окрашена интенсивно; компактный осадок
эритроцитов;
(+)—очень слабая задержка гемолиза; жидкость
окрашена интенсивно, осадок небольшой;
(±) —следы задержки гемолиза, при
взбалтывании заметен незначительный осадок;
(—)—полный гемолиз (отрицательная реакция).
РСК

45.

46.

РСК
• Если АГ и АТ не соответствуют друг другу, то их
комплекс не образуется и комплемент
остается свободным, он связывается
комплексом АГ+АТ второй индикаторной
системы и обусловливает гемолиз
эритроцитов.
Результат «-», т.е. человек здоров.
• Применяют для диагноза сифилиса RW реакция Вассермана; гонореи – реакция
Борде-Жангу, риккетсиозов, спирохетозов и
др.

47.

Реакция Вассермана (RW) – относится к группе
реакций связывания комплемента

48.

Реакция Вассермана:

49.

Реакции с использованием
меченых АГ или АТ:
РИА –радиоиммунный анализ - основан на
исследовании меченых радиоактивным йодом
АТ, разработан в 50-х годах прошлого века.
Образуется комплекс АГ+АТ, который содержит
радиоактивную метку и обнаруживается с
помощью радиометра.
Основными преимуществами РИА является
высокая чувствительность и специфичность.
Его минус: имеет определенную радиационную
опасность.

50.

РИА

51.

РИФ – реакция
иммунофлюоресценции
Впервые предложена в 1942 г.
АТ иммунной сыворотки метят флюорохромами.
Образующийся комплекс АГ+АТ обнаруживают
по наличию этой светящейся метки при
люминисцентной микроскопии – прямой метод
Кунса.
«+» в том, что быстро и достаточно точно
выявляет микробы или их АГ в исследуемом
материале от больного - метод экспресс
диагностики: прямой и непрямой метод.

52.

53.

Пневмококки, выявленные РИФ
(люминесцентная микроскопия)
Данный метод является экспрессным и высокочувствительным.
Существуют две его разновидности.
При прямом методе к исследуемой взвеси микробов,
фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную
флуорохромом. Образующийся комплекс Аг+Ат при освещении
ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает яркозеленое свечение.
При непрямом РИФ используют обычные диагностические
сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой
сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает
образование комплекса Аг+Ат. Этот комплекс выявляется с
помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки,
содержащей антитела к гаммаглобулиновой фракции крови того
вида животного, от которого была получена диагностическая
сыворотка. Светящийся комплекс выявляют при
люминесцентной микроскопии. Часто используют краситель
изотиоционат флюоресциина – ФИТЦ.

54.

ИФА – иммуноферментный
анализ
• компонент метят ферментом
(пероксидаза), который при
положительном результате реакции
включается в комплекс АГ+АТ.
• При добавлении к нему соответствующего
субстрата происходит реакция с
окрашиванием раствора в жёлтокоричневый цвет. Наиболее распространён
твердофазный ИФА.

55.

Результат ИФА. Желтый цвет раствора в лунке является
положительным результатом.

56.

https://youtu.be/wQRLp9qSyI8 - видео об одном из видов ИФА
https://youtu.be/U1OSdjf5oIs - также видео о сути реакций ИФА

57.

Иммуноблоттинг (Вестерн-блот)
Это определение АГ с помощью известных сывороток
(АТ), при котором искомый компонент выделяется с
помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
АГ переносится из геля на мембрану, активированную
бумагу или нитроцеллюлозу, после чего выявляют
искомый АГ: мембрану или др. носитель инкубируют
в растворе антител (АТ) и связанные антитела
(АТ+АГ)выявляют с помощью радиоизотопного или
ферментного методов.
Иммуноблоттинг используется как диагностический
метод при ВИЧ-инфекции.

58.

Пример:
Иммуноблоттинг для выявления
антител к коронавирусу.
А – окраска суммарных белков в геле
Кумасси G-250: 1 – маркеры
молекулярной массы 200, 150, 120, 100,
85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 кД,
2 – вирус ТГС, стрелками отмечено
положение основных белков вируса
трансмиссивного гастроэнтерита
свиней.
Б – обработка вирусных антигенов
после электропереноса на мембрану
спец.сыворотками крови: 3 – сыворотка
крови клинически здорового
организма, 4…13 – сыворотки крови,
положительные в ИФА, титр 1:200 (4, 5),
титр 1:400 (6, 7), титр 1:800 (8), титр
1:1600 (9), титр 1:3200 (10, 11), титр
1:6400 (12, 13).
справочно

59.

ВИЧ (метод иммуноблот)
Антигены из раствора, содержащего фрагменты вирусных частиц,
распределяются в зависимости от молекулярного веса при помощи
электрофореза

60.

2 часть лекции: Иммунный статус

61.

Иммунный статус
Характеристику состояния иммунной системы
организма, выраженную качественными и
количественными показателями ее
компонентов, называют иммунным статусом
(иммунограммой).
Иммунный статус определяет в сумме
индивидуальную реактивность организма и
отражает те границы взаимодействия с
окружающей средой, за которыми
нормальная реакция превращается в
патологическую.

62.

Методы оценки
иммунного
статуса
Скрининговые
Уточняющие

63.

Классификация:
I. Иммунный статус здорового организма.
II. Иммунный статус при патологии:
1. антигенспецифический
аллергический; аутоиммунный;
онкологический; посттрансплантационный;
репродуктивный; инфекционный;
2. антигеннеспецифический
иммунодефицитный (первичный и
вторичный); лимфопролиферативный.

64.

• Иммунологический мониторинг - система
динамического слежения за иммунным
статусом населения (в неблагополучных
зонах, например).
• Под данным понятием также понимают
контроль за состоянием иммунной системы
в процессе какого-либо специфического
лечения (напр., в онкологии).

65.

ПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ
ИММУННОГО СТАТУСА
1.
Предварительные клинические данные о наличии:
• первичного или вторичного ИДС
• аутоиммунного заболевания
• аллергии
• некоторых заболеваний (лейкоз, лимфома)
2.
Нарушения репродукции
3.
Подбор доноров органов/тканей и мониторинг
посттрансплантационных реакций
4.
Онкологические заболевания
5.
Оценка эффективности иммунотерапии
6.
Скрининг различных групп населения или рабочих на предприятиях с
целью выявления иммунопатологии (сотрудники атомных электростанций)
https://youtu.be/Wt1jZFiYK4c - показания у детей для постановки иммунограммы,
мнение доктора Комаровского.

66.

Показатели, характеризующие состояние
специфического звена иммунной системы:
• Уровень иммуноглобулинов всех классов в
крови.
• Количество и функциональная активность Т- и
В- лимфоцитов и их субпопуляций.
• Выраженность клеточного и гуморального
иммунитета на введение антигенов.
• Реакции ГЗТ и кожные реакции.
• Состояние системы иммуноцитокинов.
• Активность иммунного фагоцитоза и др.

67.

ЭТАПЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА
1. Анамнез
2. Данные объективного обследования
3. Иммунограмма (только на третьем
месте, строго)

68.

ТЕСТЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА
I уровень (ориентировочные):
количество лейкоцитов (относительное, абсолютное);
количество лимфоцитов (относительное, абсолютное);
Т-лимфоциты;
В-лимфоциты;
IgM, IgЕ, IgG (реакция Манчини);
Фагоцитарная активность нейтрофилов (фагоцитарный индекс,
показатель фагоцитоза).
II уровень (аналитические):
Субпопуляции Т-лимфоцитов: CD4, CD8, В-лимфоциты - CD20
(моноклональные антитела, проточная цитометрия);
NK (CD16);
IgE, специфические IgE (ИФА);
Функциональная активность нейтрофилов (НСТ, ЛКБ,
хемилюминесценция и др.);
Функциональная активность лимфоцитов (РБТЛ; РТМЛ)
Уровень цитокинов в различных биологических жидкостях;
ЦИК;
другие методы.
Знать
тесты
этого
уровня
Справочно

69.

Что входит в иммунограмму?
Справочно:
Важнейшими дифференцировочными антигенами Т- лимфоцитов человека являются следующие:
1. CD2 — антиген, характерный для Т- лимфоцитов, тимоцитов, NK клеток. Он идентичен рецептору
эритроцитов барана и обеспечивает образование розеток с ними (методика определения Т- клеток).
2. CD3 — необходимы для функционирования любых Т- клеточных рецепторов (ТКР). Молекулы CD3
имеют все субклассы Т- лимфоцитов. Взаимодействие ТКР- CD3 (она состоит из 5 субъединиц) с
представляющей антиген молекулой МНС класса 1 или 2 определяет характер и реализацию иммунного
ответа.
3. CD4. Эти рецепторы имеют Т- хелперы 1 и 2 и Т- индукторы. Являются корецептором (местом
связывания) детерминант белковых молекул МНС класса 2. Является специфическим рецептором для
оболочечных белков вируса иммунодефицита человека ВИЧ- 1(gp120) и ВИЧ- 2.
4. CD8. Популяция CD8+ Т- лимфоцитов включает цитотоксические и супрессорные клетки. При
контакте с клеткой- мишенью CD8 выступает в роли корецептора для белков HLA класса 1.

70.

ИММУНОГРАММА
Ф.И.О.___________________________________дата___________________________
возраст_____________________________________________________________
диагноз_____________________________________________________________
Показатель
Содержание
больного
у
Показатель
лейкоциты
В-клетки
лимфоциты
Ig A
(%)
Ig M
абс.ч.
Ig G
Т-клетки
Ig E
CD3
ЦИК
CD4
фагоцитоз
CD8
комплемент
Содержание
больного
у
дополнительные
иммунорегуляторный
индекс (ИРИ)
исследования
Врач-иммунолог-лаборант____________________________________________
КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
___________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________
_______
Врач-иммунолог_____________________________________________________

71.

Некоторые
референсные
значения
иммунограммы,
http://immuninfo.ru
/medinfo/immunogr
amma/ расшифровка
иммунограммы

72.

Динамика показателей лейкограммы и
иммунограммы при остром воспалительном
процессе с благоприятным исходом.

73.

ПРАВИЛА ИНТЕРПРИТАЦИИ
ИММУНОГРАММЫ
• оценка показателей в комплексе
• оценка показателей в динамике
• с учетом проводимой терапии
• с учетом клиники

74.

75.

Периоды физиологических
иммунодефицитов:
-Ранний возраст (до 13-15 лет)
-Геронтологический возраст (> 45 лет)
-Сезонный (весна-начало апреля; осень –
начало сентября)
-Беременность

76.

Классификация первичных иммунодефицитов
Спавочно:
I. Дефицит гуморального иммунитета:
• сцепленная с Х-хромосомой агаммаглобулинемия (с-м Брутона);
• общий вариабельный иммунодефицит;
• транзиторная гипогаммаглобулинемия у детей (медленный
иммунологический старт);
• селективный дефицит иммуноглобулинов (гипо IgA)
II. Дефицит клеточного звена иммунитета:
• Синдром Ди Джорджи (гипо-, аплазия тимуса);
• Хронический слизисто-кожный кандидоз.
III. Комбинированные Т- и В-имунодефициты:
• Тяжелый комбинированный иммунодефицит: а) Х-сцепленный; б)
аутосомно-рецессивный;
• Атаксия – телеангиэктазия (синдром Луи – Бар);
• Синдром Вискотта – Олдрича ;
IV. Дефицит системы фагоцитов:
• Хронический гранулематоз;
• Синдром Чедиака –Хигаси;
• Синдром гипериммуноглобулинемии Е (синдром Джоба);
V. Дефицит системы комплемента.
Врожденный ангионевротический отек.

77.

Вторичный иммунодефицит
Вторичный иммунодефицит* является
результатом соматического заболевания,
возникшего в процессе жизни, и проявляется
хроническими рецидивирующими,
вялотекущими и трудно поддающимися
обычному лечению инфекционновоспалительными процессами, выявляемыми
у пациентов в сочетании с изменениями
иммунологических показателей.
* Р.М.Хаитов, Иммунопатология и аллергология, Стандарты диагностики
и лечения, Москва, 2010 г.,

78.

Приобретенный (вторичный)
иммунодефицит*
а) развивается на фоне ранее нормально
функционирующей иммунной системы;
б) характеризуется стойким снижением
количественных и функциональных показателей
иммунного статуса;
в) является зоной риска развития хронических
инфекционных заболеваний, аутоиммунной
патологии, аллергических болезней и
опухолевых новообразований.
* Дранник Г.Н. и соавт., 2005

79.

Вторичный иммунодефицит – это снижение
противоинфекционной защиты
Клинически вторичный иммунодефицит проявляется хроническими
рецидивирующими (персистирующими) инфекционными заболеваниями
вирусной, бактериальной и грибковой природы, резистентными к
традиционному лечению:
- частые ОРВИ,
- хронический герпес, папилломавирусная инфекция, аднексит,
простатит, кандидозы кожи и слизистых оболочек, фурункулез,
карбункулез, дерматофития стоп, пиодермия и другие гнойновоспалительные заболевания,
- персистирующий вирусный гепатит,
- ангина с абсцедированием, хронический тонзиллит, синуситы
- хронический бронхит, хронический пиелонефрит, пародонтоз, сепсис,
остеомиелит и др.

80.

Классификация вторичных иммунодефицитов
(Р.Я. Мешкова и соавт., 2004 г.)
Спавочно:
I. По темпам развития:
• Острый иммунодефицит (обусловлен острым инфекционным
заболеванием, травмой, интоксикацией и др.)
• Хронический иммунодефицит (развивается на фоне хронических гнойновоспалительных заболеваний, аутоиммунных нарушений, опухолей,
персистирующей вирусной инфекции и т.д.).
II. По уровню поломки:
• Нарушение клеточного (Т-звена) иммунитета.
• Нарушение гуморального (В-звена) иммунитета.
• Нарушение системы фагоцитов.
• Нарушение системы комплемента.
• Комбинированные дефекты.
III. По распространенности:
• «Местный» иммунодефицит.
• Системный иммунодефицит.
IV. По степени тяжести:
• Компенсированный (легкий).
• Субкомпенсированный (средней тяжести).
• Декомпенсированный (тяжелый).

81.

Формы вторичных иммунодефицитов
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) (Код МКБ-10 B.20-B24)
это вторичный иммунодефицит, развивающийся в результате поражения
иммунной системы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).
Индуцированный (уточненный) вторичный иммунодефицит (Код МКБ-10
D.84.8)
возникает в результате конкретных причин, вызвавших его появление:
рентгеновское излучение, цитостатическая терапия, применение
кортикостероидов, травмы и хирургические вмешательства, нарушения
иммунитета, развивающиеся вторично по отношению к основному
заболеванию (диабет, заболевание печени, почек, злокачественные
опухоли).
Спонтанный (неуточненный) вторичный иммунодефицит (Код МКБ-10 D.84.9)
характеризуется отсутствием причины, вызвавшей нарушение иммунной
реактивности. Клинически проявляется в виде хронических,
рецидивирующих инфекционно-воспалительных процессов бронхолегочного аппарата, придаточных пазух носа, урогенитального и желудочнокишечного тракта, глаз, кожи, мягких тканей, вызванных
оппортунистическими (условнопатогенными) микроорганизмами.

82.

Степени иммунной недостаточности
(в зависимости от количества лимфоцитов,
норма –3,2-1,4х109/л):
1 степень - минимальная (ИН-1) –количество лимфоцитов
составляет 1,4-1,2 х109/л; лабораторные показатели снижены на
15-30% от нормальной величины. Клинически ИД может не
проявляться (компенсированная форма).
2 степень - средняя (ИН-2) –количество лимфоцитов составляет
1,1-0,9 х109/л; лабораторные показатели снижены на 35-55% от
нормальной величины. Клинически ИД может проявляться одним
или комбинацией нескольких клинических синдромов, подострым
или хроническим вариантом течения.
3 степень - высокая (ИН-3) –количество лимфоцитов составляет
менее 0,9 х109/л; лабораторные показатели снижены более чем на
55% от нормальной величины. Клинически ИД проявляется
выраженными клиническими симптомами.

83.

84.

Иммунокоррекция
Это раздел клинической иммунологии, изучающий способы и
методы, направленные на восстановление или изменение
функций иммунной системы.
Средства иммунокоррекции могут быть направлены как на
стимуляцию, так и на подавление иммунного ответа, и на
замещение утраченной функции. Для лечения врожденных и
приобретенных иммунодефицитов, сопровождающихся
выраженным снижением числа и функции иммунокомпетентных
клеток, проводят заместительную иммунокоррекцию (пересадка
тимуса, костного мозга, введение лейкоцитарной и
лимфоцитарной массы, препаратов иммуноглобулинов человека,
интерферонов, цитокинов и медиаторов иммунного ответа. В
некоторых случаях используют экстракорпоральные методы обработку лимфоцитов пациента in vitro цитокинами для
стимуляции их функциональной активности и возвращение
лимфоцитарной массы в кровеносное русло.
Для иммуностимуляции используют препараты различного
происхождения и действия.

85.

Справочно:

86.

Иммунокоррекция — это
активное вмешательство в
работу иммунной системы,
исправление ее дефектного
функционирования путем
стимуляции или супрессии
всей системы или ее отдельных клеточных
субпопуляций (Т-хелперы, Тсупрессоры, Т-киллеры),
стимуляция или блокада
клонов конкретной специфичности. Иммунокоррекцию
проводят
фармакологическими, физикохимическими методами и с
помощью генной инженерии
Спавочно:

87.

Глоссарий
1.
2.
3.
Иммуноиндикация
Серодиагностика
Титр сыворотки – это наиболее
высокое разведение сыворотки
(наименьшее количество антител),
при котором данная серологическая
реакция будет положительной.
4. Специфичность серологической
реакции – способность антигена
реагировать только с гомологичным
антителом.
5. Чувствительность серологической
реакции - минимальное количество
антигенов или антител, которое
можно выявить с помощью данной
реакции.
6. Реакция агглютинации
7. О-агглютинация
8. Н-агглютинация
9. Реакция непрямой (пассивной)
гемагглютинации
10. Реакция преципитации
11. Реакция кольцепреципитации
12. Реакция преципитации по
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Оухтерлони
Реакция радиальной
иммунодиффузии по Манчини
Реакция иммуноэлектрофореза
Реакция нейтрализации
Реакция лизиса
(иммунный цитолиз)
Реакция связывания комплемента
Радиоиммунный анализ
Реакция иммунофлюоресценции
Иммуноферментный анализ
Иммуноблоттинг (Вестерн-блот)
Аутоиммунные заболевания
– самостоятельно