Дифференцировка Т- и В- лимфоцитов

1.

Лекция №4
Тема: Дифференцировка Т- и Влимфоцитов.

2.

План:
1. Популяции и субпопуляции лимфоцитов,
онтогенез, функции и роль в клеточном
иммунитете.
2. Современная классификация лимфоцитов
3. Кластеры дифференцировки «СД»
лимфоцитов , методы их определения.
4. Характеристика методов определения
дифференцировочных антигенов и
рецепторов Т- и В - лимфоцитов.

3.

1.Популяции и субпопуляции лимфоцитов, онтогенез,
функции и роль в клеточном иммунитете.
Важнейшим моментом в эволюции системы
резистентности живых организмов явилось
появление нового типа клеток, на основе которого
была сформирована новая система в организме
многоклеточных. Такой клеткой стал лимфоцит.
Это специфическая клетка, которая в процессе
своей активации образует совокупность клеточных
элементов обуславливающих высокую
специфичность ответной реакции на антиген
(эпитоп).
Высокая эффективность обуславливает
появлением иммунной памяти.

4.

Лимфоциты образуются в:
лимфатических узлах ,
миндалинах ,
аппендиксе ,
селезенке ,
вилочковой железе ( тимусе )
красном костном мозге.
Выделение популяций и субпопуляций
лимфоцитов основаны на определенных
структурных и функциональных
особенностях клеток.

5.

2.Функциональная классификация лимфоцитов:
- В-лимфоциты (осуществляют
гуморальную форму иммунного ответа)
- Т-лимфоциты (осуществляют клеточную
форму иммунного ответа)
- NK, или нулевые лимфоциты (главная
функция– участвуют в
противоопухолевом иммунитете)
В и Т лимфоциты - небольшие клетки с
темным ядром, что обусловлено
конденсацией хроматина и сравнительно
небольшим количеством цитоплазмы,
содержащей разрозненные митохондрии.
NK – клетки - это большие зернистые
лимфоциты с митохондриями,
свободные рибосомами, аппарат
Гольджи и характерными плотными
гранулами, связанными с мембраной.

6.

7.

В - лимфоциты – один из классов
лимфоцитов, компонент В-системы
иммунитета, осуществляющей гуморальную
форму иммунного ответа.
Место образования: красный костный мозг.
Место обучения: у человека красный
костный мозг, кишечник, миндалины, кожа.
Медленно рециркулируют, живут несколько
недель, отсутствует кислая фосфатаза.
После преобразования антигена Влимфоциты дифференцируются в
плазматические клетки, продуцирующие
антитела.
Часть В-лимфоцитов превращается в Вклетки памяти.

8.

Т-лимфоциты – участвуют в реакциях
клеточного иммунитета.
Место образовании: красный костный мозг.
Место обучения: тимус.
Продолжительность жизни: 4-6 мес.
Содержат много лизосом, высокая
активность кислой фосфатазы, быстро
рециркулируют.
Выделяют субпопуляции:
Т-киллеры,
Т-хелперы (Th0:Th1 и Th2 ),
Т-памяти,
Т-амплификаторы (усилители),
Т-супрессоры (ингибируют активность
клеток).

9.

3.Кластеры дифференцировки «СД» лимфоцитов , методы
их определения
3.1.Кластер дифференцировки ( сокращенно СД) – это
номенклатура дифференцировочных антигенов лейкоцитов
человека
Данная классификация была предложена в 1982 году для
идентификации и исследования
поверхностных мембранных белков -лейкоцитов.
CD-антигенами (или CD-маркерами) могут быть белки,
которые служат рецепторами или лигандами,
участвующими во взаимодействии клеток между собой и
являющимися компонентами каскада определённых
сигнальных путей.
Однако, они могут быть и белками, выполняющими другие
функции (например, белки клеточной адгезии).
Список CD-антигенов, внесённых в номенклатуру, постоянно
пополняется и в настоящее время содержит 350 CD-антигенов
и их подтипов.

10.

3.2.Номенклатура
Номенклатура лейкоцитов была предложена на 1-й
Международной конференции по антигенам
дифференцировки лейкоцитов человека (Париж , 1982).
Система создана для упорядочивания большого количества
моноклональных антител к эпитопам на поверхности
лейкоцитов, полученных в лабораториях во всём мире.
Таким образом, определённый CD-антиген приписывается к
группе моноклональных антител , которые распознают
один и тот же эпитоп на поверхности клетки.
CD-антигеном также называют и сам белок-маркер, с
которым реагируют данные антитела. Следует отметить,
что данная номенклатура классифицирует кластеры
безотносительно клеточной функции белка. Нумерация
идёт в хронологическом порядке от ранее описанных
антигенов к более поздним.
Более того, многие CD-антигены являются не
поверхностными, а внутриклеточными белками-маркерами.
Некоторые из них являются не белками, а
поверхностными углеводами(например, CD15).
Сегодня насчитывается более 320 антигенов и и их подтипов.

11.

3.3.Иммунофенотипирование
Система кластеров дифференцировки
применяется в иммунофенотипировании для
отнесения клеток к тому или иному типу по
представленным на клеточных мембранах
молекулам-маркёрам.
Наличие определённых молекул может быть
ассоциировано с соответствующими
иммунными функциями.
Хотя наличие одного типа CD обычно не
позволяет точно определить популяцию
клетки , сочетания маркёров позволяют
определить её достаточно чётко.
СD-молекулы, используемые для сортировки
клеток в различных методах, таких
как проточная цитометрия.

12.

Тип популяции
СД-маркеры
стволовые клетки
СД34+, СД31-
все клетки
СД45+
гранулоциты
СД45+ СД15+
моноциты
СД45+ СД14+
Т-лимфоциты
СД45+ СД3+
Т-хелперы
СД45+ СД4+ СД3+
В-лимфоциты
CD45+,
CD19+
CD45+, CD20+
Тромбоциты
СД45+ СД61+
Естественные киллеры
CD16+, CD56+, CD3-
или

13.

4.Характеристика методов определения
дифференцировочных антигенов и рецепторов Т- и В лимфоцитов.
Для клинической практики большое значение имеет
определение разных маркеров лимфоцитов. Основная
концепция дифференцировки лейкоцитов основана на
существовании специфических мембранных рецепторов.
Так как такие рецепторные молекулы могут выступать в роли
антигенов, существует возможность их выявления с
помощью специфических антител, которые реагируют лишь
с одним антигеном клеточной мембраны.
Для улучшения диагностики необходимы стандартизация
специфичностей дифференцировочных антигенов.
В 1986 году предложена номенклатура дифференцировочных
антигенов лейкоцитов человека.
Это СД-номенклатура (cluster of differentiation – кластер
дифференцировки).
Она базируется на способности моноклональных антител
реагировать с определенными дифференцировочными
антигенами. СД-группы нумеруются.

14.

При определении общей популяции Т-клеток
используются моноклональные антитела
специфичности СД2, 3, 5, 6 и 7.
СД2. моноклональные антитела специфичности
СД2 направлены против антигена, который
идентичен “рецептору эритроцитов барана”.
Способность Т-лимфоцитов образовывать розетки с
эритроцитами барана обеспечивает простую и
надежную идентификацию этих клеток.
СД2 обнаруживается на всех зрелых
периферических Т-лимфоцитах, на большинстве
тромбоцитов, а также на определенных
популяциях клеток – О-лимфоцитов (ни Т- ни Влимфоциты).

15.

СД3. моноклональные антитела этого класса
реагируют с тримолекулярным белковым
комплексом, который ассоциирован с
антигенспецифическим рецептором Т-клетки,
являющийся основным функциональным
маркером этой популяции.
СД3 используется для идентификации зрелых Тклеток.
СД5. антиген представляет собой гликопротеин,
выявляемый на всех зрелых Т-клетках.
Определяется на поздних стадиях
дифференцировки клеток в тимусе.
Часто маркер выявляется на клетках больных с Вклеточным типом хронического лимфолейкоза.

16.

СД6.антитела специфичности.
СД6 реагируют с высокомолекулярным
гликопротеином, присутствующим на
мембране всех зрелых Т-клеток.
Антиген выявляется также на небольшой
части периферических В-клеток и
присутствует у большинства лейкозных
клеток В-клеточного типа хронического
лимфолейкоза.
СД7. выявляется у 85 % зрелых Т-клеток.
Присутствует также и на тимоцитах. Он
считается наиболее надежным критерием
диагностики острых Т-клеточных
лейкозов.

17.

Помимо этих основных Т-клеточных маркеров
известны и другие дифференцировочные
антигены Т-клеток, которые характерны либо
для определенных стадий онтогенеза, либо для
различающихся по функциям субпопуляций.
Среди них наиболее широко распространены СД4
и СД8.
СД4. зрелые СД4+ Т-клетки включают Тлимфоциты, обладающие хелперной
активностью и индукторы.
Особое значение имеет то, что СД4 связывается с
вирусом СПИДа, что приводит к
проникновению вируса внутрь клеток этой
субпопуляции.
СД8. Субпопуляция СД8+ Т-клеток включает
цитотоксические и супрессорные Т-лимфоциты.

18.

Для идентификации поверхностных структур
лимфоцитов используют 3 группы методов:
1) розеткообразование;
2) методы иммунофлюоресценции;
3) иммуноферментные методы.
Наиболее дешевым и точным методом определения
численности популяции Т-лимфоцитов является
метод розеткообразования.
Метод основан на наличии сродства между
рецептором CD2 и гликопротеинами мембраны
эритроцита барана.
При смешивании лимфоцитов с эритроцитами
барана образуются фигуры, получившие название
розеток. Количество таких розеткообразующих
клеток (Е-РОК) соответствует количеству Тлимфоцитов, для которых характерна экспрессия
на поверхности CD 2- aнтигена.

19.

Другая модификация метода розеткообразования
(ЕАС-розетки) используется для идентификации
В-клеток.
Известно, что на поверхности В-лимфоцитов
имеется рецептор для C 3-компонента
комплемента.
Для выявления этого рецептора лимфоциты
смешивают с эритроцитами быка,
последовательно обработанными
антиэритроцитарными антителами в
субагглютинирующей концентрации и
комплементом (свежезамороженной сывороткой
крови мыши). Использование такого источника
комплемента гарантирует защиту эритроцитов от
комплементзависимого лизиса.
После совместной инкубации В-клетки образуют
фигуры розеток.

20.

Более прогрессивным является метод
иммунофлюоресценции, который
позволяет с помощью наборов
моноклональных антител к различным CDантигенам идентифицировать любые
поверхностные структуры лимфоцитов.
Применение иммуноферментного метода,
удобно для небольших иммунологических
лабораторий, так как не требует дорогих
люминесцентных микроскопов.
Цветную реакцию, возникающую при
взаимодействии фермент-субстрат, можно
наблюдать в обычный световой микроскоп

21.

Домашнее задание:
Конспект лекции №4.
Теоретический материал учебника под
ред. А.А.Воробьева, В.В.Зверева
Основы микробиологии, вирусологии,
иммунологии, стр. 119-120.