7.56M

Categories:

medicine

biology

Гистология как наука. Методы исследования основы цитологии

1.

ГИСТОЛОГИЯ КАК НАУКА
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОСНОВЫ ЦИТОЛОГИИ
Доцент кафедры
гистологии и эмбриологии МА КФУ
Демьяненко И.А

2.

Гистология
- это наука, изучающая закономерности развития,
строения и функции тканей, а также межтканевые
взаимодействия в историческом и
индивидуальном развитии человека и
многоклеточных организмов.

3.

Объект гистологии- ткани
- представляют собой филогенетически
сложившиеся, топографически и функционально
связанные клеточные системы и их производные,
из которых образованы органы.

Разделы гистологии:
1) Общая гистология - изучает развитие, структуру и
функцию тканей.
2) Частная гистология – изучает микроскопическое
строение органов и систем органов.
Цитология – наука о закономерностях строения,
развития и жизнедеятельности клетки.
Эмбриология- учение о развитии зародыша,
закономерностях закладки и образования тканей и
органов.

5.

Уровни организации строения
тела человека
1) Организм
2) Аппарат органов
3) Система органов
4) Орган
5) Ткань
6) Клетка
7) Клеточные структуры
8) Молекулярный уровень

6.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ГИСТОЛОГИИ:
1) Разработка общей теории гистологии, отражающей
эволюционную динамику развития тканей и
закономерности эмбрионального и постнатального
гистогенеза;
2) изучение гистогенеза, как комплекса процессов
пролиферации, детерминации, дифференцировки,
интеграции, изменчивости, апоптоза и др.;
3) выяснение механизмов тканевой регуляции (нервной,
эндокринной, иммунной), а также возрастных
изменений тканей;

7.

4) изучение закономерностей реактивности и адаптивной
изменчивости клеток и тканей при влиянии
неблагоприятных экологических факторов и экстремальных
условий, а также и при трансплантации;
5) изучение регенерации тканей при повреждении и разработка
методов тканевой заместительной терапии;
6) изучение механизмов молекулярно-генетической регуляции
клеточной дифференцировки, наследования генетического
дефекта , разработка методов генной терапии и
использования эмбриональных стволовых клеток для
трансплантации;
7) выяснение процессов эмбриогенеза человека, критических
периодов развития и причин бесплодия.

8.

Методы исследования в гистологии
Микроскопия — изучение объектов с
использованием микроскопа и предназначается
для наблюдения и регистрации увеличенных
изображений образца.
Виды микроскопии:
оптическая (световая),
электронная,
рентгеновская,
лазерная и др.

9.

Современный оптический микроскоп
Устройство оптического микроскопа:
A — окуляр; B — объектив; C — объект;
D — конденсор; E — предметный столик;
F — зеркало.

10.

Принцип действия микроскопа:
пучок световых лучей направляется линзой
конденсора через образец, а полученное
изображение затем увеличивается с помощью
линз.
Для измерения структур в световой
микроскопии используются в основном
микрометры:
1 мкм составляет 10-6 м ;
в электронной микроскопии используются
нанометры: 1 нм составляет 10-9 м.

11.

Разрешающая способность
- это минимальное расстояние при котором две рядом
расположенные точки видны как отдельные.
Глаз человека имеет разрешающую способность около 1/10
мм, или 100 мкм. Это означает, что две точки, которые
находятся друг от друга на расстоянии менее чем 100 мкм,
сливаются в одну.
Лучший световой микроскоп имеет разрешающую
способность около 0,2 мкм, т.е. примерно в 500 раз
улучшает человеческий глаз.
Электронный трансмиссионный микроскоп –0,5–0,7 нм.
Электронный сканирующий микроскоп –5–10 нм.

12.

Методы световой микроскопии
Ультрафиолетовая
2) Флюоресцентная
3) Фазово- контрастная
4) Темнопольная
5) Интерференционная
6) Поляризационная
7) Конфокальная
1)

13.

Ультрафиолетовая микроскопия
УФ- лучи применяются в микроскопии для
повышения разрешающей способности
оптического микроскопа.
Повышение разрешающей способности
достигается применением невидимого для глаза
УФ излучения.
Средняя длина волны(λ)становится равной 0,2
мкм, т. е. в два раза меньше длины волны видимой
части спектра.

14.

Флюоресцентная (люминесцентная)
микроскопия
— специальный вид микроскопии, основанный на
использовании собственной (первичной) или
наведенной (вторичной) фотолюминесценции
микроскопических объектов.
Видимая люминесценция препарата возбуждается
либо сине-фиолетовым светом, либо УФ- лучами.
Источниками света служат ртутно-кварцевые лампы
сверхвысокого давления (типа ДРП1) или лампы
накаливания точечного типа.

15.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин,
катероламины, содержащиеся в нервных, тучных и
др. клетках после фиксации тканей по методу
Фалька (в парах формальдегида).
Вторичная флюоресценция возникает при окраске
препаратов специальными красителями
(флюорохромами), которые способны излучать
свечение при воздействии УФ- лучей.

16.

Флюорохромы
флюоресцируют по-разному в зависимости от
химического состава структур, с которыми они
взаимодействуют.
Флюорохромы: флюоресцин, акридиновый
оранжевый, родамин и др.
При окраске акридиновым оранжевым ДНК дает
ярко-зеленое свечение, а РНК- ярко-красное.
Возможно также выявление белков, липидов, ионов
и др.

17.

Флюоресцентная (люминесцентная)
микроскопия

18.

Фазово-контрастная микроскопия
— метод получения контрастных изображений
прозрачных и бесцветных живых объектов.
Данный микроскоп снабжен фазовоконтрастным устройством, которой состоит из
кольцевой диафрагмы в конденсоре и фазовой
пластинки в объективе. Благодаря смещению
фаз световой волны повышается контрастность
структур изучаемого объекта, что связанно с
разным индексом преломления.

19.

Фазово-контрастная
микроскопия
Используется для изучения
живых клеток и прозрачных
объектов.

20.

Темнопольная микроскопия
Для темнопольной микроскопии пользуются
обычными объективами и специальными
темнопольными конденсорами.
Объект освещается косыми боковыми лучами и в
объектив микроскопа попадают только лучи,
рассеянные частицами, находящимися в препарате
(как в эффекте Тиндаля), и объект становиться
видимым. Этим методом изучаются мочевые
кристаллы, микроорганизмы и др.

21.

Темнопольная микроскопия

22.

Темнопольная микроскопия
• Даёт светящееся
изображение объекта
на темном фоне.
• Используют для
наблюдения живых
неокрашенных
объектов, кристаллов.

23.

Интерференционная микроскопия
• В интерференционном микроскопе падающие на
объект световые пучки раздваиваются: один
пучок проходит через объект, другой — идет
мимо него.
• В окулярной части микроскопа оба луча вновь
соединяются и интерферируют между собой,
получается изображение объекта с участками
разной плотности.
• Этим методом можно определять концентрацию
и массу сухого в-ва в объекте.

24.

Интерференционная микроскопия

25.

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
• Принцип метода основан на изучении объекта в
свете, образованном двумя лучами,
поляризованными во взаимно перпендикулярных
плоскостях.
• Проходя через структуры со строгой ориентацией
молекул, лучи запаздывают друг относительно
друга вследствие неодинакового их преломления.
Поляризованный пучок света пропускается через
анализатор и определяется пространственное
расположение структур в объекте.

26.

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

27.

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Позволяет получать
изображения
неокрашенных
анизотропных структур,
способных к двойному
лучепреломлению
(например, коллагеновых
волокон, миофибрилл и
др.).

28.

Конфокальная микроскопия
- метод, использующий в качестве
осветителя лазерный луч, который
последовательно сканирует всю толщину
препарата.
Этим методом получают информацию о
форме клеток, структуре ядра, хромосом,
цитоскелете, а также спец. программа
осуществляет трехмерную реконструкцию
исследуемого объекта.

29.

КОНФОКАЛЬНЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ ЛАЗЕРНЫЙ
МИКРОСКОП

30.

Электронная микроскопия
В электронных микроскопах (ЭМ)
используют пучок электронов, источником
которых служит термокатод, формируется в
электронной пушке и высковольтном
ускорителе, затем дважды фокусируется
конденсорами. Длина электромагнитной
волны электронов в 100 000 раз короче
длины волны видимого света.
Разрешающая способность (РС) ЭМ в сотни
и тысячи раз больше РС светового
микроскопа.

31.

Трансмиссионная электронная
микроскопия (ТЭМ)

32.

СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ
МИКРОСКОПИЯ

33.

МЕТОД ЗАМОРАЖИВАНИЯ –
СКАЛЫВАНИЯ
• В специальном
приборе
замораживают и
скалывают клетки по
линии клеточных
мембран
• При этом стало
возможно изучение
структуры
плазмолеммы и
кариолеммы

34.

МЕТОД АВТОРАДИОГРАФИИ
• - позволяет изучать распределение в клетках и тканях
веществ, в состав которых искусственно введены
радиоактивные изотопы (3Н, 14С, 32Р и др.).
• Введенный в организм животного изотоп включается в
соответствующие структуры (напр. меченый тимидин — в
ядра клеток, синтезирующих ДНК).
• Метод основан на способности включенных в клетки
изотопов восстанавливать бромистое Ag фотоэмульсии,
которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся
после проявления фотоэмульсии зерна Ag (треки) служат
своего рода автографами, по локализации которых судят о
включении в клетку примененных веществ.

35.

МЕТОД РАДИОАВТОГРАФИИ
• Метод определяет:
скорость включения меченых
аминокислот в белки,
образование нуклеиновых
кислот, обмен йода в клетках
щитовидной железы и др.

36.

Гистохимические методы
• В их основе лежит применение химических
реакций для выявления распределения
химических веществ в структурах клеток,
тканей и органов. Современные
гистохимические методы позволяют
обнаруживать аминокислоты, белки,
нуклеиновые кислоты, различные виды
углеводов, липидов и др.
Пример: ШИК- р-ция на гликоген

37.

Цитоспектрофотометрия
- метод изучения химического состава
клетки, основанный на избирательном
поглощении теми или иными веществами
лучей с определенной длиной волны.
По интенсивности поглощения света,
которая зависит от концентрации вещества,
производится количественное определение
его содержания в клетке.

38.

ИММУНОГИСТОХИМИЯ
Для выявления специфических белков
используют иммуноцитохимические
реакции.
Для этого получают специфические
сыворотки, содержащие антитела
(например, против белка микротрубочек —
тубулина).
Далее химическим путем соединяют эти
антитела с флюорохромом (или другим
маркером).

39.

Если меченые антитела нанести на
гистологический срез, они вступают в
соединение с соответствующими белками
клетки и возникает специфическое свечение,
видимое в люминесцентном микроскопе.

40.

ИММУНОГИСТОХИМИЯ
В основе метода лежит
визуализация реакции
антиген-антитело.
Этим методом можно
выявлять клетки
определенных типов (В и Т –
лимфоциты), рецепторы к
гормонам, структуры
гликокаликса и белки
цитоскелета в клетках.

41.

Основные этапы приготовления
гистологических препаратов для световой
микроскопии:
1. взятие материала (образца);
2. хим. фиксация (формалин);
3. промывка в воде;
4. 1-я дегидратация (этил.спирт от 60% до
100%) ;
5. просветление (бензол);
6. инфильтрация (ксилол/парафин);
7. уплотнение (заливка в парафин);

42.

8. приготовление срезов (микротом)
- срез 2-10 мкм;
9. монтаж срезов на предметное стекло;
10. удаление парафина (ксилол);
11. регидратация (этил.спирт от 100% до 60%)
12.окрашивание ;
13. 2-я дегидратация (этил.спирт от 60% до
100%) ;
14. заключение срезов в смолу хвойных
деревьев (Сибирский или Канадский бальзам)
и покрытие покровным стеклом.

43.

МЕТОДЫ ОКРАСКИ ПРЕПАРАТОВ
КРАСИТЕЛИ
ОСНОВНЫЕ
Для окраски базофильных
структур
КИСЛЫЕ
Для окраски оксифильных
структур

44.

КРАСИТЕЛИ
СПЕЦИАЛЬНЫЕ
(железный
гематоксилин,
СОЛИ Ag,
ОРСЕИН)
ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ
(Судан III,IV
ШИК-реакция)

45.

МЕТАХРОМАЗИЯ
- способность отдельных красителей изменять
цвет при связывании с определенными
структурами клеток и тканей
(напр. метахромазия гранул в тучных клетках).

46.

Основные этапы приготовления
гистологических препаратов для электронной
трансмиссионной микроскопии:
• 1. взятие материала (образца);
• 2. фиксация (глутаральдегид, Os2O4 осмиевая кислота);
• 3. промывка в фосфатном буфере;
• 4. дегидратация (этил.спирт от 25% до 100%)
5. просветление (пропилен оксид);
• 6. инфильтрация (пропилен
оксид/эпоксидная смола);

47.

7. уплотнение (эпоксидная смола);
8. приготовление срезов (ультратом)
- полутонкие срезы (0,5-1 мкм)
- ультратонкие срезы ( 30-50 нм)
9. монтаж срезов на металлическую сеточку
10.окрашивание (контрастирование) срезов
солями тяжелых металлов.

48.

Трансмиссионная электронная
микроскопия (ТЭМ)

49.

Клетка-
ограниченная мембраной,
упорядоченная система
биополимеров (белки,
липиды, углеводы,
нуклеиновые кислоты) и их
комплексов, образующих ядро
и цитоплазму,
осуществляющих
поддержание и
воспроизведение всей
системы в целом.

50.

Компоненты клетки:
• Плазмолемма
• Ядро
• Цитоплазма:
- гиалоплазма (матрикс цитоплазмы)
- органеллы
- включения

51.

• Состав плазмолеммы:
• 1) белки (интегральные, периферические)60%
• 2) липиды-40%
• 3) углеводы-5-10%
Различают также
- надмембранный слой (гликокаликс),
- подмембранный слой – кортикальный.

52.

Плазмолемма

53.

КЛАССИФИКАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ
ОРГАНЕЛЛЫ
МЕМБРАННЫЕ
НЕМЕМБРАННЫЕ

54.

МЕМБРАННЫЕ ОРГАНЕЛЛЫ –это большая часть
органелл клетки. Они отграничены от
содержимого гиалоплазмы мембраной и
представляют собой замкнутые зоны:
ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы,
митохондрии
НЕМЕМБРАННЫЕ – органеллы не имеющие
мембраны:
цитоскелет: микротрубочки, микрофилламенты,
рибосомы

55.

56.

КЛАССИФИКАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ
ОРГАНЕЛЛЫ
ОБЩЕГО
НАЗНАЧЕНИЯ
СПЕЦИАЛЬНОГО
НАЗНАЧЕНИЯ
ОРГАНЕЛЛЫ ОБЩЕГО НАЗНАЧЕНИЯ – постоянные
структуры клеток, обеспечивающие процессы их
жизнедеятельности: митохондрии, ЭПС, комплекс
Гольджи, лизосомы, рибосомы, пероксисомы и др.