Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1.

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2.

Литературные данные
• Хлорофилл, зеленый пигмент растений, - доступный длинноволновый
флуорофор ( em = сколько нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных лекарственных веществ в виде
агрегатов с карбоцианиновыми флуорофорами предложена ею же.**
• Однако не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3.

Цель работы:
Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4.

Методика работы. Схема визуализатора
Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать красных светодиодов с максимумом излучения 660 нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

5.

Выделение хлорофилла из шпината
• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция (чем)
5

6.

Спектры поглощения
Спектры флуоресценции
Возьмите нормальные засмусленные
спектры (когда станете защищаться, сечас не
надо)
Фракция хлорофилла «а»
Фракция хлорофилла «б»
Фракция феофитинов
Выделенные фракции распознавали,
сравнивая спектры фракций с
литературными спектрами хлорофиллов
«а» и «b»
Хлорофилл а флуоресцирует, а хлорофилл b – нет.
Далее использовали хлорофилл a.
Полученный в ходе очистки раствор разбавляли в …
раз.
6

7.

Условия определения
цефтриаксона:
• хлорофилл 30-40 мкл
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30
мкл
• вода до 300 мкл
• ПГМГ (0,0056 М) 60 мкл
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл
• анализируемый раствор 100
мкл.
7

8.

Условия определения
бензилпенициллина:
8
хлорофилл 10-20 мкл
фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл
вода до 300 мкл
ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл
анализируемый раствор 150 мкл.

9.

Здесь тоже нужно условия
Этот слайд явно не сюда. Не в это место
Я уже забыл, зачем он был нам нужен (вы
• Флуоресценция тройного агрегата с блеомицином малостабильна:
флуоресценция контроля и агрегата с блеомицином сразу после
приготовления отличается почти вдвое, однако в течение 10 мин
разница практически исчезает.
9

10.

Исправьте, как на предыд.
Только синяя кривая!!!
10
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• блеомицин (0,005 М в воде) 10
мкл.

11.

Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• винорелбин (0,0093 М в
воде) 10 мкл.
11

12.

• Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с
катионными, так и с анионным ПАВ (ЦТАБ и ДДС).
• Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разность сигнала и
контрольного опыта.
12

13.

Тогда сюда вставить слайд про ко-ион с блеомицином
13

14.

Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• метотрексат (0,005 М) 100
мкл.
14

15.

15

16.

16

17.

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
В воде
Аналит
В моче
Предел
Общее число
Линейный
Предел
Общее число
Линейный
обнаружения, М
точек
диапазон, М
обнаружения, М
точек
диапазон, М
Блеомицин
1,1Е-04
12
(1,1-1,7)Е-04
-
-
-
Винорелбин
3Е-04
20
(3,4-6,5)Е-04
-
-
-
Метотрексат
1,4Е-04
12
(1,4-5,0)Е-04
7,6Е-04
14
(2,7-7,6)Е-04
Бензилпенициллин
5Е-05
15
1,0Е-03
22
-
От 4,0Е-05 до
2,7Е-04
17

18.

• Без ПГМГ тройные агрегаты хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного
опыта (без блеомицина).
• ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину: флуоресценция возрастает в
диапазоне концентраций ПГМГ (1 г/л) от 0 до 20 мкл.
• Эффект ПГМГ-коиона наблюдается только с блеомицином.
18

19.

Контейнеры для визуализации доставки
лекарственных веществ
19

20.

Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
Частицы: размер 10-1000 нм, дзета-потенциалы около 0 мВ.
20

21.

• Для получения контейнеров с винорелбином изучены плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малеинированные хитозаны.
• Только контейнеры с карбоксиметилированным хитозаном сохраняют
флуоресценцию после выделения осаждением.
• Другие полимеры дали осадок, флуоресцирующий на уровне контрольного опыта.
21

22.

это все, что
изучали, или что выбрали оптимальное??
Аналит
Полимер
Немодифицированный хитозан
Цефтриаксон
Метотрексат
Винорелбин
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
22

23.

* В сшитых контейнерах с винорелбином и хитозанами нет
разницы с контрольным опытом
* Переход к работе с несшитыми контейнерами
23

24.

В течение двух суток уменьшается разница с контрольным опытом в случае тройных агрегатов с
цефтриаксоном. Сохраняется в случае несшитых контейнеров с немод. хит. а в выводе у нас карб и
мал и плюроники, это весенние данные. А сильное увеличение сигнала со сшитыми может быть
связано с выталкиванием цефтриаксона из агрегатов.То есть таким образом и комментировать?
24

25.

Флуоресценция тройных агрегатов с винорелбином сохраняется в течение 2-х суток в том
случае, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или лаурат в ацетоне, в случае
лаурата в воде разница контроль/неконтроль появляется через сутки.
25

26.

Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне в случае тройного агрегата с
винорелбином и контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным,
малеинированным сульфатированным хитозанами, плюроником F-68. В системах с лауратом
флуореценция через сутки возрастает.
26

27.

27

28.

Состав контейнера
Время диализа до разрушения контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Винорелбин
Плюроник F-68
Лаурат в ДМСО
1 час
Винорелбин
Плюроник F-127
Лаурат в ДМСО
1 час
Метотрексат
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 минут
Метотрексат
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Метотрексат
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение часа,
контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном также устойчивы к
диализу по крайней мере в течение 45 минут. Разрушение контейнеров с метотрексатом и
плюрониками начинается в течение 10 минут.
28

29.

29

30.

Интенсивность флуоресценции клеток
Результаты эндоцитоза
1) Есть поглощение контейнеров клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра клеток после интернализации контейнеров.
Доставка в ядро интересна для визуализации доставки противораковых
веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
30

31.

1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и
противоионом и показана возможность их использования для определения цефтриаксона,
блеомицина, метотрексата, винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на
уровне 0,1 мМ, а метотрексата и бензилпенициллина в искусственной моче на уровне 1
мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно
заряженным полимером (блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) (+) –
додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие ПГМГ («ко-иона») флуоресценция
агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без блеомицина). Для
ранее изученных модельных аналитов эффект ко-иона не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными
веществами и противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками
получены контейнеры для визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и
винорелбина в эукариотические клетки.
31

32.

4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить
устойчивого сигнала модельных лекарственных веществ. Показана возможность
длительного сохранения флуоресценции выше сигнала контрольного опыта в
тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах на основе
карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат –
плюроник F-68 (или F-128 или карбоксиметилированный хитозан) во время диализа
против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 2 ч (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 20
мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и
метотрексатом в клетки аденокарциномы молочной железы человека с
сохранением флуоресценции выше контрольного опыта. Наблюдали
распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную
мембрану и ядрышко ядра.
32