Микроорганизмы – объекты биотехнологии. Лекция 12

1.

Лекция 12. Микроорганизмы – объекты
биотехнологии
1. Свойства микроорганизмов……………....
2. Получение микроорганизмов для
промышленного культивирования………..
3. Виды микроорганизмов для
биотехнологии……………………………….

2. Свойства микроорганизмов

1
Свойства микроорганизмов

3.

Свойства микроорганизмов, используемые в производстве
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Малые размеры: даже в огромном количестве
занимают небольшой объем
Огромная скорость размножения
Чрезвычайно активный обмен веществ
Синтез БАВ в количествах, намного превышающих
потребность клетки
Выделение продуктов из клетки во внешнюю среду
Способность расти на дешевых субстратах, отходах
производства
Возможность быстрого видоизменения методами
селекции и генетической инженерии

4. Морфология бактериальной клетки

Выросты
клеточной
стенки
Плазмиды
Нуклеоид (главная
цепь ДНК) 1,4 мм
Клеточная
стенка
Включения
запасных веществ
Рибосомы
Цитоплазматическая мембрана

5.

Объем клетки диаметром 0,15 мкм содержит около
1200 молекул белка и осуществляет примерно 100
ферментативных реакций.
Геном бактерии содержит 5 тыс. генов и представлен
нуклеоидом - одной кольцевой суперспирализованной
хромосомой. У ряда бактерий в цитоплазме есть
дополнительные молекулы ДНК в виде кольцевой
плазмиды.
Длина бактериальной хромосомы составляет 1мм, т.е. в
1000 раз превышает размер клетки, молекулярная масса
– 109 Да.

6. Состав бактериальной клетки (масса клетки 2× 10-12 г)

Компонент
Содержание, % Число молекул
Вода
70
40 000 000 000
Белок
15
1 000 000
Сахара
3
200 000 000
Жиры
2
25 000 000
Аминокислоты
0,4
30 000 000
ДНК
1

7. 2. Огромная скорость размножения

4722366482869645213696
Количество бактерий
472× 1019
68 719 476 736
64
16
8
4
2
1
0 20
40
80
100
2 ч.
12 ч.
472×1019 × 2×10-12 = 944 ×107 г = 9440
24 ч.
Минуты,
часы

8. Деление бактериальной клетки

• Размножение бактерий осуществляется путем их
роста и деления (обычно бинарное).
• Деление бактериальной клетки происходит каждые
20 – 40 минут, в отличие от животной клетки,
делящейся через 24 часа. Есть бактерии, способные
к делению через 8 мин.

9.

Кольцевая хромосома
Дочерняя хромосома
Репликация (удвоение) кольцевой хромосомы бактерии
Прикрепление дочерней хромосомы к мембране
20 мин.

10.

Клеточная стенка
Мембрана
Миграция хромосом к полюсам клетки - 25 мин.
Образование клеточной мембраны и клеточной стенки - 38 мин.
Образование двух дочерних бактерий - 45 мин.

11. 3. Чрезвычайно активный обмен веществ

«Энергетический обмен организма в покое
пропорционален не массе, а поверхности тела.»
Правило Рубнера (1893 г.)
Уровень метаболической активности микроорганизмов
на много порядков выше, чем у макроорганизмов.

12.

Сравнение площади поверхности макро- и микроорганизмов
Площадь поверхности бактерии
(масса = 2 × 10-15 кг)
R= 1 мкм
Sшара = 4πR2
= 4×3,14×(0,5×10-6)2
= 3,14×10-12 м2
h = 1 мкм
Sобщая = 6,28×10-12 м2
Sцилиндра= 2πR×h
= 2 ×3,14 ×0,5
=×10-6×1×10-6
=3,14×10-12 м2

13.

Площадь поверхности коровы
(масса = 500 кг)
S поверхности шкуры = 3…4 м2

14.

Сравнение площади поверхности макро- и микроорганизмов
4 м2
Корова
Масса = 500 кг
Бактерия
Масса = 2 × 10-15 кг
Sшкуры = 4 м2
S поверхности = 6,28 × 10-12 м2
500 кг =
= 2,5×1017
бактерий
Sобщая = 2,5 × 1017 × 6,28 × 10-12 =
=1,57 × 106 м2
= 1 570 000 м2
= 1,57 км2

15. 4. Синтез биологически активных веществ в количествах, намного превышающих потребность клетки

Гены микроорганизмов обладают сильными
промоторами, обеспечивающими интенсивную
транскрипцию матричной (информационной) РНК.

16.

Способность к биосинтезу белка у разных организмов за сутки
Животные
(корова, вес 500
кг)
Растения
(соя, вес 500 кг)
Производят
0,5 кг
5 кг
Микроорганизмы
(дрожжи, вес 500 кг)
белка
50 000 кг

17. 5. Выделение продуктов из клетки во внешнюю среду

Микробы обладают «внешним пищеварением», т.е.
все ферменты, расщепляющие питательные вещества
и биологически активные вещества (БАВ) выделяются
наружу.
А
B2
B2
Химические
соединения
Ферменты
Аминокислоты
Витамины
Антибиотики

18. 6. Способность расти на дешевых субстратах, отходах производства

Виды субстратов
Питательные вещества
Гидролизаты древесных и
сельскохозяйственных отходов
Гидролизаты торфа
Сульфитный щелок
Меласса
моносахара 2 - 4,5%,
уксусная кислота 0,5%
Молочная сыворотка
моносахара до 6 %,
моносахара 2,5 - 5%
сахароза до 55% от
сухого в-ва
лактоза 4- 4,8%
7. Способность к быстрому видоизменению методами
селекции и генетической инженерии

19.

2
Получение
штаммов микроорганизмов для
промышленного культивирования

20.

Методы получения штаммов для
биотехнологического производства
отбор из природных популяций
отбор из природных популяций с последующей
селекцией
индуцированный мутагенез с последующей селекцией
модификация методами генетической инженерии

21. Природные изоляты

1. Микроорганизмы - продуценты антибиотиков:
Penicillium notatum, продуцент пенициллина, выделен из
воздуха (А.Флеминг, 1928)

22. Природные изоляты

1. Микроорганизмы - продуценты антибиотиков:
Bacillus brevis - продуцент антибиотика грамицидина, выделен из почвы (Р.Ж.
Дюбо 1939)
Penicillium crustosum - продуцент пенициллина, изолирован из воздуха в
Московском метрополитене (З.В.Ермольева,1942)
Актиномицет Streptomyces – продуцент стрептомицина, выделен
при
исследовании почвенной микрофлоры ( З.Ваксман, 1944)
Bacillus subtilis - продуцент антибиотика В-545, является сапрофитом,
представителем почвенной микрофлоры (1944 г.)
Плесневой гриб Cephalosporium acremonium - продуцент нескольких
антибиотиков, (в том числе
цефалоспорин С,
эффективентый против
устойчивых к пенициллину грамположительных бактерий), выделен у берегов
Сардинии из морской воды (1945 г.)
Актиномицет Actinomyces venezuelae - продуцент левомицетина, изолирован из
почвы (1947 г.)
2. Микроорганизмы для пищевой промышленности:
Природная эпифитная микрофлора используется с древних времен для
получения вина, пива, хлеба, кисломолочных продуктов.

23. 2. Штаммы, полученные в ходе селекции

Многие годы основным доступным методом
улучшения штаммов был поиск активных в нужном
направлении штаммов среди случайных мутантов и
подбор условий культивирования с целью изменения
регуляторных механизмов. Улучшенные штаммы
выводились веками и были связаны, в основном, с
пищевой микробиологией.

24. 3. Индуцированный мутагенез и селекция

УФ-лучи
Исходная популяция
Погибшие
колонии
Выжившая мутантная колония
Селекция в течение нескольких поколений
Новый штамм микробов

25.

Селекция
микроорганизмов
основана
на
экспериментальном
мутагенезе
и
отборе
наиболее
продуктивных штаммов действием рентгеновских и
ультрафиолетовых
лучей
и
некоторых
химических
соединений.
Вероятность возникновения мутации – 10-6, но благодаря
высокой интенсивности размножения есть возможность найти
полезную мутацию по интересующему признаку.
Благодаря методу индуцированного мутагнеза и селекции
были подобраны высокопродуктивные, по сравнению с
исходными, штаммы, продуцирующие витамина В2 в 20000,
витамина В12 в 50000, пенициллина в 10000 раз больше
первоначальных.

26. 4. Получение генетически модифицированных микроорганизмов

Разрезание ДНК
плазмиды
рестриктазой
1. Создание вектора
Сшивание фрагментов
ДНК лигазой
Получение
донорской ДНК
Рекомбинантная
векторная ДНК

27.

2. Перенос векторных молекул в бактериальные клетки
Трансфекция бактерий
векторными частицами
Генетически
модифицированный штамм
3. Отбор трансформированных
клеток
Репликация вектора:
клонирование и экспрессия
чужеродной ДНК

28. Направления создания ген-модифицированных микроорганизмов

Штаммы-суперпродуценты первичных метаболитов:
витаминов, аминокислот. Достигается за счет
увеличения в клетке копий соответствующего гена
путем введения в нее плазмид, содержаших
дополнительные копии гена.
Штаммы-продуценты
белков
эукариотических
организмов: животных и человека. Создаются путем
переноса в клетки бактерий генов высших
организмов с помощью векторов, обеспечивающих
экспрессию генов эукариот (производство инсулина,
интерферона, соматостатина)

29. - Штаммы-суперпродуценты первичных метаболитов

Исходный штамм
Выделение
нужного гена
Вектор с копией гена
Трансформация
бактерий
Многократная
репликация гена в
составе вектора,
повышенная
экспрессия фермента
Штамм-суперпродуцент

30. - Штаммы-продуценты эукариотических белков

Белок
Фирма
Инсулин («Хумулин»)
Elli Lilly
Сахарный диабет
Интерферон αа2
Hoffman-La Roche
Саркома Капоши
Интерферон γb2
Genentech
Хронический
гранулематоз
Соматотропин
Elli Lilly
Дефицит гормона
роста, карликовость
Гормон роста
Genentech
Антигемофильный
фактор
ДНКаза I
Заболевание
Milex
Гемофилия А
Genentech
Муковисцидоз

31. Получение рекомбинантного инсулина

Молекула инсулина, состоящая из α- и β-цепей, образуется путем
выщепления специальными ферментами из молекулы проинсулина Спептида. Такое посттрансляционное «созревание» молекул белка
называется процессингом.
В бактериальных клетках процессинг эукариотических белков
невозможен. Поэтому для экспрессии гена инсулина в клетках E. coli
сначала искусственно синтезировали ген-эквивиаленты – фрагменты
ДНК, кодирующие только последовательности аминокислот, входящих
в состав α- и β-цепей зрелой молекулы белка инсулина. Эти гены
были
встроены
в
структурную
часть
гена
фермента
антранилатсинтетазы и в составе плазмидного вектора введены в
бактериальные клетки.
После синтеза химерного полипептида, из него выщепляют
последовательности α- и β-цепей, которые затем смешивают и
химическим путем индуцируют образование дисульфидных связей.

32.

Инсулин – (от лат. «инсула» – остров) гормон, способствующий
понижению концентрации глюкозы в крови вследствие её депонирования в
печени в виде гликогена. Вырабатывается в поджелудочной железе
клетками островков Лангерганса.
β-клетки островка
Лангерганса
Поджелудочная
железа
Инсулин

33.

Структура инсулина (С254Н377N65O76S6):
Про инсулин
С – пептид (35)
α – цепь (21)
S
S
S
S
S
β – цепь(30)
S

34.

Схема получения генноинженерного
инсулина – «Хумулина»
Трансформация бактерий
Ген α -цепи
α-цепь
Ген β-цепи
β-цепь
Встраивание ген-эквивалента в
плазмидный вектор
Химерный
белок
“Зрелая” молекула
инсулина

35.

В настоящее время во всем мире насчитывается 246 млн.
больных сахарным диабетом, а к 2030 г. это число достигнет 380
млн. человек.
В России официально зарегистрировано 2,5 млн. больных
сахарным диабетом. Однако, истинная численность больных
диабетом в 3-4 раза превышает официально зарегистрированную и
составляет около 8 млн. человек (5, 5% от всего населения России).
Обычно инсулин выделяли из поджелудочной железы животных
(свиней, коров). Для получения 100 г очищенного инсулина
расходовалось 725 кг поджелудочной железы. Из 1000 литров
бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина.
Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400
млн. долларов, ежегодное потребление около 2500 кг.
Развитие отечественного производства инсулинов позволит
сэкономить валютные средства и ослабить зависимость от мировой
конъюнктуры цен на данную группу лекарственных препаратов.

36. Источники получения генов для трансформации микроорганизмов

Гены,
синтезируемые
искусственно
«обратная генетика»
Белок
Комплементарная
ДНК
Геномная ДНК
Клетки
(обратная транскрипция)
Ткань
мет лиз цис тре ала
Генетический код:
мет =АУГ, лиз =ААА,
цис=УГУ и т.д
ДНК ген-эквивалента
----ТАЦТТТАЦА-------АТГАААТГТ----
Тканеспецифическая м-РНК
Ядерная ДНК
к-ДНК гена
Геномная ДНК гена
Прокариоты
(бактерии)
Эукариоты
(дрожжи)

37.

3
Виды микроорганизмов для
биотехнологии

38. Микроорганизмы для современной микробиологической промышленности

Эукариоты
Грибы
Прокариоты
Бактерии
Бактерии
Не образующие
споры
Актиномицеты
Образующие
споры
Бациллы
Клостридии
Плесневые
грибки
Дрожжи
безмицелиальные
грибы

39. Бактерии

Бактерии (от bacterion - палка, палочка) –
группа прокариотических организмов в виде
одиночных клеток или несложных группировок
сходных клеток, обусловленных формой роста и
плоскостями деления и размножения клеток.

40. Escherichia coli

- (кишечная палочка) – «рабочая
лошадка»
современной
микробиотехнологии,
широко
используется как биопродуцент
различных биологически активных
веществ, в том числе с на основе
ген-модифицированных штаммов.

41. Streptococcus lactis

Streptococcus thermophylus
Streptococcus cremoris
используются для приготовления молочнокислых продуктов

42. Lactobacterium acidophilum –

используется для
производств
кисломолочных
продуктов

43. Propionibacterium freudenreichii –

используется для приготовления сыров

44. Corynobacterium glutamicum –

используется для производства L-лизина и глутамина

45. Xantomonas campestris –

используется для получения полисахарида ксантана

46. Бациллы

Бациллы (род Вacillus) - группа бактерий,
способных к образованию внутри клетки споры
равной по диаметру клетке. Род объединяет аэробные
и
факультативно-анаэробные
гетеротрофные
микроорганизмы, обитающие преимущественно в
почве.
Микроорганизмы рода Bacillus продуцируют
многие ферменты, расщепляющие полисахариды,
белки, жиры и другие макромолекулы, что
используется для промышленного получения этих
ферментов

47. Bacillus subtilis -

Bacillus subtilis (сенная палочка), используется
для производства ферментных
препаратов (амилосубтилина,
протосубтилина).

48. Bacillus thuringiensis –

Спора
используется для производства
биоинсектицидных
препаратов,
образует наряду с экзотоксинами
кристаллический эндотоксин
Кристаллы
эндотоксина

49. Bacillus popilliae -

Bacillus popilliae используется для производства
биоинсектицидных
препаратов,
вызывающих
у
насекомых
«молочную» болезнь

50. Bacillus megaterium

51. Bacillus polymyxa -

Бациллы для производства
антибиотиков
Bacillus polymyxa полимиксин В
Bacillus brevis –
грамицидин С

52. Клостридии

Клостридии
(род Clostridium) – группа
бактерий, способных к образованию внутри клетки
споры, имеющей больший диаметр, чем клетка. При
этом последняя раздувается в форме «веретена» или
«теннисной ракетки».
Бактерии относятся к строгим анаэробам,
способным к брожению, обитают в почве, водоемах,
кишечнике человека и животных. Микроорганизмы
рода Clostridium – возбудители различных видов
брожения, продуценты аминокислот

53. Clostridium acetobutylicum –

используется при
производстве бутанол,
ацетона, в перспективе –
источник биотоплива

54. Актиномицеты

(rpеч. actis - луч, mycos - rpиб) - лучистые гpибки гpуппа микроорганизмов, относящаяся к прокариотам,
но имеющая некоторое сходство с гpибами.
Разнообразная группа грамположительных бактерий,
включающая в настоящее время более 60 родов.
Размножаются эти бактерии бинарным делением,
фрагментацией нитевидного мицелия или путем
образования спор.
Среди
актиномицетов
много
продуцентов
антибиотиков, таких как стрептомицин, левомицитин,
тетрациклины.

55. Actinomyces israelii-T

56. Грибы (плесневые грибки)

В настоящее время насчитывается около 100 тыс. видов грибов.
Биологические особенности:
• верхушечный рост
• наличие клеточной стенки
• неподвижность
• гетеротрофный тип питания
• отсутствие хлорофилла
• способность к синтезу хитина в качестве структурного компонента
клеточной стенки
• способность образовывать споры - покоящиеся клетки
Ранее грибы относились
к царству
Fungus, откуда и
встречающиеся в литературе производные этого слова – например,
фунгициды (химические соединения, убивающие грибы).
В соответствии с принятой в настоящее время систематикой
грибов. основанной на важнейших признаках половой стадии их
развития (телеоморф), грибы составляют царство Mycota

57. Классификация грибов

Mycota
Царство
Zigomycota
Отделы
Подотделы
Neomycota
Ascomycota
Deutromycota
Basidiomycota
Классы
Endomycetes
Ascomycetes
Ustomycetes
Basidiomicycetes
Половые
структуры
зигоспоры
половые
сумки
базидии
отсутствуют
Мицелий
без перегородок
Одноклеточные
формы
с перегородками
без пряжкек
отсутствуют
с перегородками
с пряжками
дрожжи
с перегородками
без пряжкек

58. Виды культивируемых грибов

Penicillium
chrysogenum
Monascus
purpurea
Penicillium
notatum
Asprgillus
niger
Asprgillus
oryzae

59. Дрожжи

Дрожжи – представители класса
аскомицетов– безмицелиальные,
не образующие хлорофилла
одноклеточные грибы. Внешне
они представляют довольно
крупные (до 10 мкм) овальные
или
округлые
клетки
с
дифференцированным ядром. В
их цитоплазме находятся однадве вакуоли, гликоген, волютин,
капли жира, митохондрии.
Дрожжи
широко
распространены в природе, они
встречаются на плодах и
листьях растений.

60. Виды дрожжей

Rhodotorula
rubla
Saccharomyces
rouxii
Saccharomyces
carlsbergensis
Rhodotorula
pallid a
Hansenula
capsulata
Saccharomyces serevisiae
Candida utilis
Phaffia
rhodozyma
Aureobosidium
pullulans
Trichosporon
cutaneum
Cryptococus
laurentii
Hanseniaspora
guilliermondii
Saccharomycopsis
lipolytica
Saccharomycopsis
capsularis
Metschnikovia
pulcherrima

61. Размножение дрожжей

Дрожжевая клетка с
образующимися почками
Деление дрожжевой
клетки

62. Почкование дрожжевой клетки

63.

Конец