Иммунобиотехнология

1. Иммунобиотехнология

2.

Основы иммунологии
• Иммунитет - врожденная или приобретенная способность
макроорганизма к защите, специфически направленная против
любых генетически чужеродных для него агентов (от лат.
immunitas – освобождение от чего-либо).
• Иммунитет функционально направлен на уничтожение клеток и
веществ, генетически отличающихся от собственных, и на
сохранение постоянства внутренней среды макроорганизма
(гомеостаза) в течение всей его жизни.
• Иммунная
система
(ИС)
–
система
органов
и
специализированных клеток макроорганизма, реагирующая на
генетически
чужеродную
информацию/субстанцию
и
участвующая
в
защите
макроорганизма
от
такой
информации/субстанции.
• Иммунный ответ (ИО) – совокупность иммунных реакций
организма на воздействие чужеродного агента.
• Чужеродный агент, способный
называется антигеном.
вызвать
иммунный
ответ,

3. Органы иммунной системы

Аденоиды
Гланды
(миндалины)
Тимус
Грудной
лимфатический проток
Аппендикс
Органы иммунной системы
по морфологическим признакам
отождествляют с лимфоидными органами,
т.к. основным типом клеток в них
являются лимфоциты, их предшественники
и потомки.
Левая подключичная
вена
Лимфатические узлы
Селезенка
Пейеровы бляшки
толстого кишечника
Костный мозг
Центральные органы ИС –
костный мозг, фабрициева сумка
(лат. bursa Fabricii) у птиц
и ее аналог у млекопитающих,
тимус (вилочковая железа).
Периферические органы ИС –
селезенка, лимфатические узлы
и многочисленные рассеянные
по всему организму скопления лимфоцитов,
находящихся на различных стадиях
дифференцировки.

4. Органы и клетки иммунной системы

Tk
T
h
Костный мозг
Ts
Т-лимфоциты
Тимус
60-80%
Костный мозг
Аг
В-лимфоциты
15-20%
Прекурсор
Пролимфоцит
Селезенка
Антитела
Плюрипотентная
стволовая клетка;
Stem-клетка
НК-клетки
5-15%

5. Клетки иммунной системы

• В-лимфоциты (B-клетки) – (от лат. bursa). Лимфоциты,
возникающие в процессе АГ-независимой дифференцировки
стволовых клеток в фабрициевой сумке у птиц (или ее аналоге у
млекопитающих) и в костном мозге. После миграции в селезенку
превращаются в антитело-образующие клетки, т.е. участвуют в
выработке антител.
• Т-лимфоциты (Т-клетки) – (от лат. tymus). Тимус-зависимые
лимфоциты. Появляются в процессе АГ-независимой
дифференцировки стволовых клеток в тимусе. Делятся на
несколько популяций, которые взаимодействуют с Влимфоцитами, убивают зараженные вирусом клетки,
активируют макрофаги и выполняют многие другие функции.
• NK-клетки (нулевые лимфоциты) - большие гранулярные
лимфоциты, обладающие цитотоксичностью против опухолевых
клеток и клеток, зараженных вирусами. NK-клетки не обладают
антигенной специфичностью и не приобретают
иммунологическую память. Они обеспечивают
неспецифический противоинфекционный иммунитет, а также
являются главным звеном противоопухолевой защиты.
• Фагоциты (Нейтрофилы. Макрофаги. Дендритные клетки)

6.

7. Виды иммунокомпетентных клеток

• Антигенпредставляющие клетки (АПК)
(дендритные АПК, макрофаги и моноциты,
В-лимфоциты)
• Эффекторные клетки (Т-киллеры
клеточного иммунитета, плазматические
клетки гуморального иммунитета)
• Регуляторные клетки (Т-хелперы и Тсупрессоры)
• Клетки памяти.
Главная функция
плазматической клетки–
выработка антител.
Это неподвижная короткоживущая
клетка утрачивает многие рецепторы Влимфоцита.

8.

Функции моноцитов и макрофагов:
Неспецифическая защита против микробов, опухолевых и зараженных вирусами
клеток.
Участие в иммунных реакциях в качестве антиген-презентирующих клеток.
Фагоцитоз стареющих и погибших клеток.
Регуляторная. Их секреты регулируют состояние межклеточного вещества а также
функциональную активность и пролиферацию других клеток.
Механизмы действия Т-киллеров
1)
2)
Т-киллеры выбрасывают из своих гранул белки перфорины. Эти молекулы
встраиваются в чужую плазмолемму и формируют в ней сквозные поры, которые
постепенно увеличиваются в диаметре. Это нарушает осмотическое равновесие,
клетка набухает и гибнет.
Через перфориновые поры Т-киллеры также впрыскивают в чужую клетку гранзимы
– ферменты, которые запускают апоптоз – программируемую клеточную гибель
(самоубийство).
Т-киллеры образуются также Т-клетки памяти.
Т-хелпер активирует В-лимфоцит.
Т-супрессоры угнетают активность иммунных реакций.

9.

НК - большие гранулярные лимфоциты,
обладающие цитотоксичностью против
опухолевых клеток и клеток, зараженных
вирусами
инициация антигензависимой
дифференцировки

10. Виды иммунитета

• Гуморальный иммунитет – развертывается по линии
выработки антител, и основной процесс между АТ и АГ
происходит в сыворотке крови (humor); к основному процессу
подключаются другие сывороточные факторы (комплемент,
цитокины). По этому пути осуществляется
противоинфекционная защита.
• Клеточный иммунитет – осуществляется
сенсибилизированными Т-лимфоцитами, при непосредственном
контакте с клеткой-«мишенью». На Т-лимфоцитах-«киллерах»
имеются специальные рецепторы, которые соединяются с
«мишенью» и «убивают» ее посредством цитотоксического
лизиса. К этим процессам подключается комплемент.

11. Врожденный и приобретенный иммунитет

12. Антигены

Антиген (АГ) – любая чужеродная субстанция (вирусная, бактериальная,
химическая, природная, тканевая), способная вызвать иммунный ответ.
Полноценные антигены – антигены, индуцирующие иммунный ответ
организма и специфически реагирующие с иммунокомпетентными клетками
и антителами.
Гаптены (неполные антигены) – вещества (как правило,
низкомолекулярные, Мв < 1000 Да), взаимодействующие со
специфическими антителами, но неспособные вызывать иммунный ответ.
Приобретают способность вызывать иммунный ответ при конъюгации с
крупными молекулами – носителями гаптенов (динитрофенил,
пенициллин, формальдегид).
Антигенная детерминанта (эпитоп) – участок поверхности молекулы
антигена, специфически связывающийся с АГ-связывающим участком
(паратопом) антитела.
Валентность антигена – число молекул антител, с которым может
взаимодействовать данный антиген.
Антигенность (антигенная специфичность) – способность антигена
взаимодействовать с АГ-специфическими рецепторами Т- и В-лимфоцитов
и антителами.
Чужеродность – способность выступать антигеном в отношении данного
организма.
Иммуногенность – способность антигена вызывать иммунный ответ.

13.

Иммуноглобулин класса G (IgG)
L
L
H
H
Fab – antigen binding Fragment
Fc – Fragment crystallizable
C – константный домен (Сonstant)
V – вариабельный домен (Variable)

14.

Какие бывают антитела?
Классы иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD :
IgM (иммунноглобулины класса M) — это самые первые антитела, которые
образуются при появлении незнакомых антигенов. Поэтому это основные
антитела, которые синтезируются у новорожденных и младенцев. IgM:
максимум у младенцев.
Полезный вывод: если к антигенам конкретного микроба обнаружены IgM, то в
организме идет острый инфекционный процесс.
IgG — основной класс антител (до 75%). При первом контакте с антигеном
образование IgM вскоре сменяется образованием большого количества IgG.
Обнаружение большого количества этих антител указывает на выздоровление
или на то, что конкретное заболевание перенесено недавно. И еще. Из всех
классов только IgG способны проникать через плаценту к плоду.
IgA (до 15-20%) — секретируются на поверхность эпителия, находятся в слюне,
слезах, молоке. Они защищают слизистые оболочки дыхательных, половых,
мочевыводящих и других путей.
IgE (их мало, 1-2%) — участвуют в аллергических реакциях.
IgD – очень мало.

15.

Упрощённая схема of V(D)J рекомбинации
В основе разнообразия антител лежат 3
механизма: соматическая
рекомбинация, неточность связей
(добавление лишних нуклеотидов)
между V, D и J сегментами и
гипермутагенез (на 9 порядков выше).
Разнообразие антител. Для
распознавания всего многообразия
антигенов окружающей среды иммунная
система должна вырабатывать не менее
108 антител разной специфичности
(потенциально 1016 ). Специфичность
антител определяется аминокислотной
последовательностью вариабельных
областей легких и тяжелых цепей.
Разнообразие антител обеспечивается
уникальным строением участков ДНК,
кодирующих вариабельные области. В
зрелом B-лимфоците участок ДНК,
кодирующий вариабельную область
тяжелой цепи, состоит из трех генов,
которые обозначаются V, D и J, а
вариабельная область легкой цепи — из
двух генов — V и J. Костномозговой
предшественник B-лимфоцита содержит
множество вариантов этих генов. В
процессе созревания B-лимфоцита они
случайным образом комбинируются друг с
другом, образуя единый комплекс,
состоящий из одного гена V, одного гена D
и одного гена J. Увеличению разнообразия
антител способствуют также мутации этих
генов.

16. Гибридомная технология получения моноклональных антител

ГАТ-среда:
гипоксантин,
аминоптерин,
тимидин

17.

18.

Видео:
https://yandex.ru/video/preview/?filmId=15069742552659262091&from=tabbar&text
=%D0%B8%D1%84%D0%B0
https://www.youtube.com/watch?v=UAcE99TINqY
https://www.youtube.com/watch?v=uL_qDTMtfmQ

19.

Ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA).
•Сенсибилизация
подложки АГ
•Отмывание
•Добавление
тестируемых АТ
• АГ в солевом растворе инкубируют на пластиковой
подложке или в пробирках, в результате чего небольшое его
количество адсорбируется на поверхности пластика.
• Количество тестируемых АТ определяют по содержанию
окрашенного продукта реакции путем сканирования
оптической плотности.
Фермент, связанный
с лигандом
•Отмывание
•Добавление
лиганда
Лиганд
•Отмывание
•Добавление
хромогена
•«Проявление
подложки»
Хромоген

20. Использование ИФА-диагностики

• ГЕПАТИТ
• ЭНТЕРОБАКТЕРИИ
• ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
• СТАФИЛОКОККИ
• СИФИЛИС
• КОРИНЕБАКТРИИ
• ХЛАМИДИОЗ
• ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР,
ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА
• ГЕРПЕСНЫЕ ИНФЕКЦИИ
• В КЛИНИЧЕСКОЙ
БИОХИМИИ (ГЛЮКОЗА,
• АТИПИЧНАЯ ПНЕВМОНИЯ БЕЛОК, МОЧЕВИНА,
АЛЬБУМИН)
• ИНФАРКТ МИОКАРДА
• ТОКСОПЛАЗМОЗ

21.

Целевая доставка
лекарства к клеткемишени

22.

Вакцины
Эффект вакцинации (vacca – корова) был
открыт Дженнером более 200 лет назад
вакцинация (vaccinatio; франц. vaccination) -- метод
создания активного иммунитета против инфекционной
болезни путем введения вакцины в организм человека или
животного;
Вакцинация
Выработка антител к
патогенному
микроорганизму
Инактивация при
повторном
заражении

23. Требования, предъявляемые к современным вакцинам

• Иммуногенность;
• Низкая реактогенность (аллергенность);
• Не должны обладать тератогенностью (способностью
нарушать нормальное развитие эмбриона и
вызывать появление различных аномалий развития);
• Не должны обладать онкогенностью;
• Штаммы, из которых приготовлена вакцина, должны
быть генетически стабильны;
• Длительный срок хранения;
• Технологичность производства;
• Простота и доступность в применении.

24. Ограничения:

• не все патогенные микроорганизмы удается
культивировать;
• для получения вирусов животных и человека
требуются дорогостоящие культуры животных
клеток;
• возможность инфицирования персонала;
• риск попадания живых и неослабленных
микроорганизмов в партию вакцин;
• вирулентность;
• изменение активности с течением времени

25. КЛАССИФИКАЦИИ ВАКЦИН

По составу:
• –моновакцины
—
содержат
антигены одного серовара (вакцины
против туберкулеза, ВГВ);
• –поливакцины (поливалентные) —
содержат
антигены
нескольких
сероваров (вакцины против гриппа,
полиомиелита,
пневмококковых
инфекций, лептоспироза);
• –ассоциированные
(комбинированные,
комплексные,
многокомпонентные) — содержат
антигены нескольких видов (КПК,
АКДС)

26. КЛАССИФИКАЦИИ ВАКЦИН

По цели применения:
А.
Вакцины
для
профилактики
инфекционных заболеваний:
В
плановом
порядке,
согласно
календарю прививок, всем лицам,
указанным в календаре и не имеющим
противопоказаний.
По эпидемическим показаниям
«Туровая»
вакцинация
допривить неохваченные
группы населения.
с
целью
вакцинацией
Вакцинация на коммерческой основе
• Б. Вакцины для лечения инфекционных
заболеваний:
• Для лечения хронических инфекций

27. КЛАССИФИКАЦИИ ВАКЦИН

По способу введения в
организм вакцины:
1.Накожные
2.Внутрикожные
3.Подкожные
4.Внутримышечные
5.Интраназальные
6.Пероральные

28. КЛАССИФИКАЦИИ ВАКЦИН

По
кратности
введения
различают
вакцины:
–
вводимые однократно — все
живые, кроме полиомиелитной;
– с последующими бустерными
иммунизациями
и
ревакцинациям:
инактивированные,
субъединичные,
анатоксины,
рекомбинантные.
По происхождению вакцины
для профилактики
инфекционных заболеваний
разделяют на используемые в
настоящее время и
перспективные

29. В зависимости от природы, характера и способа получения вак­цины классифицируются (по А. А. Воробьеву) на:

В зависимости от природы, характера и способа получения
вакцины классифицируются (по А. А. Воробьеву) на:
живые (аттенуированные,
дивергентные,
рекомбинированные
(векторные);
комбинированные (из живых
и неживых вакцин).
• неживые или
инактивированные —
корпускулярные
(цельноклеточные,
цельновирионные,
субклеточные, субвирионные)
и молекулярные
(биосинтетические природные
и генно-инженерные,
химически синтезированные)

30. КЛАССИФИКАЦИЯ ВАКЦИН

Синтетические
бактериальные
•Действующим
токсины в
началом в них
измененной
•Они содержат
служат
убитые
ослабленные
безвредной форме.
патогенные
микроорганизмы,
К ним относятся
микроорганизмы
потерявшие
известные и
или их
способность
широко
фрагменты.
вызывать
Примером
служат
заболевание, но
применяемые
вакцины против
стимулирующие
гриппа, клещевого вакцины против
иммунный ответ.
дифтерии,
энцефалита,
К этой группе
столбняка,
бешенства,
относятся
брюшного тифа.
вакцины против
коклюша
кори, краснухи,
полиомиелита,
эпидемического
паротита и Дивергентные: Бацилла Кальметта-Герена или БЦЖ (Bacillus Calmette-Guérin, BCG)
гриппа.
штамм ослабленной живой коровьей туберкулёзной палочки Mycobacterium bovis

31.

32.

33.

Должна ли вакцина содержать целые клетки ?
Субъединичные вакцины
Очищенные поверхностные белки, отдельные компоненты микроорганизма
Идентификация компонентов,
индуцирующих выработку
антител
Выделение
соответствующего
гена
Клонирование гена с помощью
экспрессирующей системы,
далее - получение белка
Достоинства:
+
+
+
очищенный иммуногенный белок стабилен и безопасен
химические свойства известны
отсутствуют другие белки и нуклеиновые кислоты => отсутствие нежелательных
побочный эффектов
Недостатки:
- очистка специфического белка стоит дорого
- конформация выделенного белка может отличаться от нативной =>изменение
его антигенных свойств
Используются в случае, если вирус онкогенный, и невозможно использование
аттенуированных вакцин

34.

Пептидные вакцины
Короткие пептиды, имитирующие эпитопы
Применяются, если внутренние части белка не
существенны, не влияют на конформацию
иммуногенного домена
Химический синтез отдельных доменов
Сшивка с инертным белком
(предотвращает их разрушение)
Введение в организм хозяина
Выявление набора пептидов,
при котором наблюдается
выработка антител в количестве
достаточном для защиты

35.

Векторные вакцины
На основе вируса коровьей оспы (ВКО)
Достоинства:
имеет широкий спектр хозяев
не обладает онкогенными свойствами
жизнеспособен в течение многих
лет после лиофилизации
ВКО реплицируется в цитоплазме
инфицированных клеток, а не в ядре
2.Трансформация плазмидой культуры
животных клеток, предварительно
инфицированных ВКО
Рекомбинация между гомологичными
последовательностями генома ВКО и
участками плазмиды
3.Отбор с помощью ДНК-зонда,
гибридизующегося с геном антигенного
белка
1.Встраивание сегмента ДНК в
плазмидный вектор

36. ВЕКТОРНАЯ ВАКЦИНА (Спутник V)

37. мРНК ВАКЦИНА

38. Вакцина против туберкулеза

Патент РФ 2170588
Микробную массу культуры БЦЖ выращивают на
твердом картофеле. Время выдержки – 1 неделя.
После она «дозревает» на жидких синтетических
средах, откуда ее:
•снимают;
•отфильтровывают;
•промывают высушивающей средой;
•пропускают через шуттель-аппарат (растирают
металлическими бусами до состояния однородного
порошка);
•пудра разводится стабилизатором. Цель –
получение взвеси, в которой содержится 50 мг
вещества на 1 мл;
•раствор центрифугируют в течение 15-20 минут на
скорости 2 000 об/мин.;
•порошок вновь разводят все тем же
стабилизатором для получения надосадочной
взвеси с концентрацией 0,5 мг Mycobacteria bovis в
1 мл;
•препарат разливается по ампулам и
0,9% раствор NaCl