Теоритические основы ПЦР. Состав реакционной смеси

1.

Теоритические основы ПЦР.
Состав реакционной смеси.
Презентацию выполнила
Студентка медико-биологического факультета
2 курс, 3 группа
Акинина Александра

2.

Понятие ПЦР
Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — метод молекулярной
биологии, позволяющий добиться значительного увеличения
малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой
кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить
множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами
(введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко
используется в биологической и медицинской практике,
например, для диагностики заболеваний (наследственных,
инфекционных), для установления отцовства,
для клонирования генов, выделения новых генов.

3.

Основные принципы
ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе
повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного
температурного цикла?
Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для
начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают
"праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров
должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и
именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНКполимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов,
комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле
вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц
изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий
участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить
следующим образом:
• денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
• отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии
определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
• элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72°С - 1 минута (время зависит от
длины синтезируемого фрагмента).

4.

Приборная база для применения метода
полимеразной цепной реакции в лаборатории
должна состоять из
• амплификатора(или, как его еще называют,
термоциклера);
• системы для гель-электрофореза с источником питания
(для визуализации результатов ПЦР);
• системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР);
• ПЦР-бокса(для пробоподготовки);
• вортекса;
• микроцентрифуги;
• набора автоматических дозаторов (механических или
электронных).

5.

Помимо основного и вспомогательного оборудования для
полноценного функционирования ПЦР-лаборатории,
необходимы некоторые расходные материалы: стерильные
наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.
Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для
проведения полноценной полимеразной цепной реакции
включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером,
праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК,
комплементарные началу и концу анализируемого участка
ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также
абсолютно необходима очищенная вода.

6.

Компоненты реакционной смеси
• Праймеры -искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15
до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в
образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают
специфичность и чувствительность тест-системы.
• Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи
ДНК согласно принципу комплементарности
• Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфа-та (дАТФ),
дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и
дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - «строительный материал», используемый Taqполимеразой для
синтеза второй цепи ДНК.
• Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные
условия для реакции, а также стабильное значение рН.
• Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который
может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для
последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт
амплификации не образуется.