Применение реакции кольцепреципитации в судебной медицине

1.

Федеральное государственное бюджетное образование. Учреждение высшего образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства Здравоохранения Российской
Федерации (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России)
Кафедра: Микробиологии, вирусологии и иммунологии.
ТЕМА: «ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ
КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ В СУДЕБНОЙ МЕДИЦИНЕ»
В Ы П ОЛ Н И Л А : РАС Т У Н О ВА Е К АТ Е Р И Н А
ГРУППА 215

2.

Реакция преципитации (реакция термокольцепреципитации
Асколи) относится к реакциям сероиндикации.
Сероиндикация – комплекс иммунологических реакций,
направленных на обнаружение АГ возбудителя в исследуемом материале
без выделения чистой культуры возбудителя с помощью заведомо
известных АТ.

3.

Реакция преципитации (реакция термокольцепреципитации Асколи) –
это осаждение растворимого АГ при действии АТ в присутствии электролита.
Видимый эффект реакции (феномен преципитации) –
помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

4.

Этот метод был разработан Асколи (1910) в основном для
исследования кожевенного сырья на сибирскую язву. Эта реакция получила
и другое название – асколизация кожевенного сырья.
Обязательное условие постановки реакции преципитации — это
прозрачность раствора антигена и иммунной сыворотки, поэтому при
необходимости компоненты реакции освобождают от взвешенных частиц
фильтрованием, например, через асбестовую вату.

5.

Компоненты реакции преципитации.
1. Антиген (преципитиноген) -это антиген молекулярной природы, находящийся в
мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или
экстракты тканей и др.
2. Антитела (преципитины)находятся в сыворотке крови человека или в иммунных
диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.
3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

6.

Получение преципитиногена.
Преципитиноген получают путем измельчения материала и извлечения
из него белковых антигенов кипячением или другими способами.
Примеры преципитиногенов: лизаты или экстракты различных
органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор, в
первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур
микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.

7.

Получение преципитирующих
сывороток.
Получают преципитирующие сыворотки путем гипериммунизации
кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат
антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.
Примеры преципитирующих сывороток: преципитирующая
сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя
сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая
сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и
др.
Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение
преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.

8.

Методы постановки реакции
преципитации.
1. Метод наслаивания
В уленгутовские пробирки (диаметр 2...3 мм) вносят
пастеровской пипеткой с тонким капилляром, не смачивая
стенок пробирки, 0,3...0,4 мл иммунной преципитирующей
сыворотки. Затем по стенке пробирки осторожно наслаивают
на поверхность сыворотки 0,1...0,2 мл растворимого
исследуемого антигена (преципитиногена). Смешивания
компонентов не происходит благодаря различию плотности
сыворотки и экстракта.
Учет результатов проводят на фоне темной бумаги. Через
1...2мин в зоне взаимной диффузии антигена и антител, на
границе контакта компонентов, происходит помутнение среды,
видимое сбоку как серо-белый диск (преципитат).

9.

2. Метод подслаивания
В пробирку вначале вносят антиген, а затем осторожно при помощи
пастеровской пипетки на дно пробирки, под антиген, «подслаивают»
иммунную сыворотку.

10.

3. Микровариант РКП.
Разработан для экономии компонентов. В этом случае используют
стеклянные капилляры или тонко оттянутые кончики пастеровских пипеток
диаметром 0,5... 1 мм. Капилляр опускают одним концом во флакон с преципитирующей сывороткой, набирают ее на высоту 1...1,5 см, закрывают
верхнее отверстие капилляра указательным пальцем.
Затем ватой удаляют излишек сыворотки с наружной стороны
капилляра, погружают его в раствор антигена и набирают равное
количество антигена. Капилляр переворачивают с таким расчетом, чтобы
смесь сыворотки и антигена оказалась в середине капилляра, после чего
закрепляют вертикально в пластилиновой пластинке. Результаты
учитывают, как и при обычной РКП.

11.

Контроли реакции преципитации.
При постановке кольцевой РП в ходе исследования тканевого материала
необходимы следующие контроли:
1) иммунная сыворотка + стандартный антиген;
2) иммунная сыворотка + физиологический раствор;
3) иммунная сыворотка + экстракт из тканей здоровых животных.

12.

Показания РП считают достоверными, если в первом
контроле получают положительный, а в остальных —
отрицательный результат.

13.

Применение.
Применяют реакцию кольцепреципитации для обнаружения
неизвестного АГ при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской
язве, туляремии, менингите, оспе.
В судебной медицине ее используют для определения видовой
принадлежности крови, спермы;
В санитарно-гигиенических исследованиях – для установления
фальсификации пищевых продуктов.

14.

Применение в судебной медицине.
К постоянно используемым в экспертной практике
основным методам определения видовой
принадлежности крови относятся кольцепреципитация в
жидкой среде.
Данная реакция помогает установить, принадлежит
ли кровь человеку или животному.
Во многих случаях одно только установление вида
крови может сыграть значительную, если не
решающую, роль в раскрытии преступления или
обстоятельств происшествия. Это относится ко всем
случаям браконьерства, незаконного убоя скота,
авиационных происшествий.

15.

Подготовка объектов.
1) Пятна крови на вещественных доказательствах и контрольные
участки предметов-носителей экстрагируют стерильным физиологическим
раствором при температуре +4—6°С в течении 18—72 ч.
2) Белки в пятнах из следов крови или другого объекта доводят до
приблизительного содержания 1:1000 под контролем пробы Геллера с
азотной кислотой. При работе с пятнами малых размеров в реакции
электропреципитации можно использовать ниточки из пятен крови
размерами 0,1 × 0,1 см.

16.

Для постановки реакции преципитации в жидкой среде в конические
пробирки с соответствующими надписями помещают вытяжки из пятен крови,
антиген и изотонический раствор натрия хлорида.
В каждый объект исследования наслаивают преципитирующую сыворотку
так, чтобы отношение антигена и антитела составляло 1:10.
Наблюдение ведут в течение часа, отмечая время появления преципитата.
Положительным результатом реакции считается выпадение колец преципитата в
пробирках с вытяжками из пятен крови и в пробирках с антигенами, при
отсутствии таковых в пробирках с вытяжками из предмета-носителя и
физиологического раствора.

17.

Спасибо за внимание!