Similar presentations:
Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений
1.
Московский государственный университетим. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023
2.
Литературные данные• Хлорофилл, зеленый пигмент растений, - доступный длинноволновый
флуорофор ( em = сколько нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных лекарственных веществ в виде
агрегатов с карбоцианиновыми флуорофорами предложена ею же.**
• Однако не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2
3.
Цель работы:Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3
4.
Методика работы. Схема визуализатораСхема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать красных светодиодов с максимумом излучения 660 нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5
5.
Выделение хлорофилла из шпината• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция (чем)
5
6.
Спектры поглощенияСпектры флуоресценции
Возьмите нормальные засмусленные
спектры (когда станете защищаться, сечас не
надо)
Фракция хлорофилла «а»
Фракция хлорофилла «б»
Фракция феофитинов
Выделенные фракции распознавали,
сравнивая спектры фракций с
литературными спектрами хлорофиллов
«а» и «b»
Хлорофилл а флуоресцирует, а хлорофилл b – нет.
Далее использовали хлорофилл a.
Полученный в ходе очистки раствор разбавляли в …
раз.
6
7.
Условия определенияцефтриаксона:
• хлорофилл 30-40 мкл
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30
мкл
• вода до 300 мкл
• ПГМГ (0,0056 М) 60 мкл
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл
• анализируемый раствор 100
мкл.
7
8.
Условия определениябензилпенициллина:
8
хлорофилл 10-20 мкл
фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл
вода до 300 мкл
ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл
анализируемый раствор 150 мкл.
9.
Здесь тоже нужно условияЭтот слайд явно не сюда. Не в это место
Я уже забыл, зачем он был нам нужен (вы
• Флуоресценция тройного агрегата с блеомицином малостабильна:
флуоресценция контроля и агрегата с блеомицином сразу после
приготовления отличается почти вдвое, однако в течение 10 мин
разница практически исчезает.
9
10.
Исправьте, как на предыд.Только синяя кривая!!!
10
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• блеомицин (0,005 М в воде) 10
мкл.
11.
Условия определениявинорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• винорелбин (0,0093 М в
воде) 10 мкл.
11
12.
• Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как скатионными, так и с анионным ПАВ (ЦТАБ и ДДС).
• Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разность сигнала и
контрольного опыта.
12
13.
Тогда сюда вставить слайд про ко-ион с блеомицином13
14.
Условия определенияметотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• метотрексат (0,005 М) 100
мкл.
14
15.
1516.
1617.
Характеристики методик определения лекарственных веществв воде и искусственной моче
В воде
Аналит
В моче
Предел
Общее число
Линейный
Предел
Общее число
Линейный
обнаружения, М
точек
диапазон, М
обнаружения, М
точек
диапазон, М
Блеомицин
1,1Е-04
12
(1,1-1,7)Е-04
-
-
-
Винорелбин
3Е-04
20
(3,4-6,5)Е-04
-
-
-
Метотрексат
1,4Е-04
12
(1,4-5,0)Е-04
7,6Е-04
14
(2,7-7,6)Е-04
Бензилпенициллин
5Е-05
15
1,0Е-03
22
-
От 4,0Е-05 до
2,7Е-04
17
18.
• Без ПГМГ тройные агрегаты хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольногоопыта (без блеомицина).
• ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину: флуоресценция возрастает в
диапазоне концентраций ПГМГ (1 г/л) от 0 до 20 мкл.
• Эффект ПГМГ-коиона наблюдается только с блеомицином.
18
19.
Контейнеры для визуализации доставкилекарственных веществ
19
20.
Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
Частицы: размер 10-1000 нм, дзета-потенциалы около 0 мВ.
20
21.
• Для получения контейнеров с винорелбином изучены плюроники F-68 и F-127,несульфатированный и сульфатированный малеинированные хитозаны.
• Только контейнеры с карбоксиметилированным хитозаном сохраняют
флуоресценцию после выделения осаждением.
• Другие полимеры дали осадок, флуоресцирующий на уровне контрольного опыта.
21
22.
это все, чтоизучали, или что выбрали оптимальное??
Аналит
Полимер
Немодифицированный хитозан
Цефтриаксон
Метотрексат
Винорелбин
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
22
23.
* В сшитых контейнерах с винорелбином и хитозанами нетразницы с контрольным опытом
* Переход к работе с несшитыми контейнерами
23
24.
В течение двух суток уменьшается разница с контрольным опытом в случае тройных агрегатов сцефтриаксоном. Сохраняется в случае несшитых контейнеров с немод. хит. а в выводе у нас карб и
мал и плюроники, это весенние данные. А сильное увеличение сигнала со сшитыми может быть
связано с выталкиванием цефтриаксона из агрегатов.То есть таким образом и комментировать?
24
25.
Флуоресценция тройных агрегатов с винорелбином сохраняется в течение 2-х суток в томслучае, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или лаурат в ацетоне, в случае
лаурата в воде разница контроль/неконтроль появляется через сутки.
25
26.
Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне в случае тройного агрегата свинорелбином и контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным,
малеинированным сульфатированным хитозанами, плюроником F-68. В системах с лауратом
флуореценция через сутки возрастает.
26
27.
2728.
Состав контейнераВремя диализа до разрушения контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Винорелбин
Плюроник F-68
Лаурат в ДМСО
1 час
Винорелбин
Плюроник F-127
Лаурат в ДМСО
1 час
Метотрексат
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 минут
Метотрексат
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Метотрексат
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение часа,
контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном также устойчивы к
диализу по крайней мере в течение 45 минут. Разрушение контейнеров с метотрексатом и
плюрониками начинается в течение 10 минут.
28
29.
2930.
Интенсивность флуоресценции клетокРезультаты эндоцитоза
1) Есть поглощение контейнеров клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра клеток после интернализации контейнеров.
Доставка в ядро интересна для визуализации доставки противораковых
веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
30
31.
1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами ипротивоионом и показана возможность их использования для определения цефтриаксона,
блеомицина, метотрексата, винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на
уровне 0,1 мМ, а метотрексата и бензилпенициллина в искусственной моче на уровне 1
мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно
заряженным полимером (блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) (+) –
додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие ПГМГ («ко-иона») флуоресценция
агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без блеомицина). Для
ранее изученных модельных аналитов эффект ко-иона не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными
веществами и противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками
получены контейнеры для визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и
винорелбина в эукариотические клетки.
31
32.
4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получитьустойчивого сигнала модельных лекарственных веществ. Показана возможность
длительного сохранения флуоресценции выше сигнала контрольного опыта в
тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах на основе
карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат –
плюроник F-68 (или F-128 или карбоксиметилированный хитозан) во время диализа
против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 2 ч (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 20
мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и
метотрексатом в клетки аденокарциномы молочной железы человека с
сохранением флуоресценции выше контрольного опыта. Наблюдали
распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную
мембрану и ядрышко ядра.
32