Применение метода центрифугирования в генной инженерии

1.

Презентацию выполнили
студентки группы Х-41 БО
Сухарева Мария, Линкевич Полина,
Урина Наталья, Глибина Екатерина.
Ярославль, 2015 г.

2.

Современный уровень знаний биохимии ,
молекулярной биологии и генетики позволяет
рассчитывать на успешное развитие новой
биотехнологии - генной инженерии, т. е.
совокупности методов, позволяющих путем
операций in vitro (в пробирке) переносить
генетическую информацию из одного
организма в другой. Перенос генов дает
возможность преодолевать межвидовые
барьеры и передавать отдельные
наследственные признаки одних организмов
другим.

3.

4.

Разделение ДНК и РНК центрифугированием
Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых кислот,
широко используемым при их очистке, является
центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия . В
этом случае высокая ионная сила буферного раствора в
центрифужных пробирках способствует диссоциации комплексов
белков и нуклеиновых кислот, и разделение макромолекул
происходит на основании их различий в плавучей плотности.
Перемещение макромолекул во время центрифугирования
происходит до тех пор, пока они не достигнут зоны раствора CsCl с
плотностью, равной их плавучей плотности. В этой зоне происходит
их концентрирование. Метод центрифугирования в градиенте
плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется
в генной инженерии для получения векторных плазмид в
препаративных количествах. Он позволяет отделять
суперскрученные молекулы ДНК от релаксированных и линейных,
так как их плавучие плотности заметно различаются из-за разного
количества молекул бромистого этидия, интеркалированного в эти
топологические изомеры плазмидной ДНК.

5.

6.

В практической генной инженерии для очистки векторных
плазмид центрифугирование в градиенте плотности CsCI
используется редко. В целях обычного применения
рекомбинантных ДНК, в том числе для молекулярного
клонирования разработаны методы минипрепаративного
выделения. В одном из них суперскрученные молекулы
рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от
линейных молекул хромосомной и плазмидной ДНК в
процессе щелочной денатурации с последующей быстрой
нейтрализацией раствора. При этом в основном успевают
ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК,
так как две их цепи остаются физически связанными друг с
другом в процессе денатурации. Образовавшийся комплекс
денатурированной ДНК и белков отделяется от плазмидной
ДНК центрифугированием, а от основной массы РНК
освобождаются переосаждением в присутствии высокой
концентрации LiCl.
Широко распространенным методом фракционирования
нуклеиновых кислот по размерам молекул является
центрифугирование в градиенте концентрации глицерина.